Общая микробиология. Виды микроскопии назначение и принципы применения
 Скачать 1.57 Mb.
|
Вопросы для самоподготовки
Литература
Микроорганизмы, главным образом, бактерии, являются оптимальной моделью для генетическиx исследований по целомy рядy причин:
Постановка флюктуационного теста Лурия и Дельбрюка для выявления частоты спонтанных мутаций, возникающих в бактериальной популяции без предварительного воздействия какого-либо мутагена. Чтобы определить частоту стрептомицинустойчивых спонтантных мутантов в культуре кишечной палочки, чувствительной к стрептомицину, её засевают одновременно в одну пробирку с 10 мл МПБ и в 10 пробирок с 1 мл той же среды по 100-1000 клеток. После инкубации посевов при 37 ºС в течение 24 часов из каждой пробы делают высевы в чашки Петри с МПБ, содержащем 10 ЕД. стрептомицина. Пробы из первой пробирки (с 10 мл МПБ ) в количестве 0,1 мл засевают на 10 чашек и на отдельные чашки в том же объеме 0,1 мл из каждой пробирки на отдельную чашку. Общее число посевов таким образом составляет 20 чашек, которые впоследствии инкубируют в течение 18-20 часов (рис. 1). В случае роста на агаровой среде со стретомицином стрептомицинрезистентных бактерий, образовавшихся только в течение суточного контакта с антибиотиком, число колоний на всех чашках должно быть примерно одинаковым. Образование на чашках различного числа колоний, выросших при высеве из отдельных пробирок в исследуемой популяции бактерий, свидетельствует о наличии в ней стрептомицинрезистентных мутантных клеток (Strr).Значительные колебания (флюктуации) количества мутантных клеток обусловлены различным временем возникновения мутаций. Культура, в которой мутация произошла ещё до высева на чашки, будет содержать большее число стрептомицинрезистентных клеток и наоборот. Такие флюктуации могут проявиться только при высеве из отдельной пробирки на свою чашку. При высеве из общей пробирки мутанты независимо от момента их возникновения будут равномерно распределены по всей популяции бульонной культуры. Постановка опытов трансформации. В качестве реципиента используют культуру стрептомицинчувствительных сенных палочек Bacillus subtilis. Донором является ДНК, выделенная из стрептомицинрезистентного штамма сенной палочки. Селективной средой для отбора трансформантов служит агар, содержащий 100 ЕД стрептомицина. Для осуществления трансформации к 1 мл бульонной культуры сенной палочки добавляют 1 мкг./ мл ДНК донора и инкубируют при 37С в течение 30 минут. После этого на 5 минут в пробирку вносят 0,1 мг/ мл раствора фермента ДНК-азы в 0,5 мл хлорида магния для разрушения ДНК, не проникшей в бактериальные клетки реципиента. Затем 0,1 мл неразведенной смеси высевают на селективную среду в чашку Петри. Чтобы определить количество клеток реципиентной культуры, готовят ее десятикратные разведения в изотоническом растворе хлорида натрия до 10–5-10-6 и высевают в объёме 0,1 мл на агар без стрептомицина. При этом контролем служит посев на агар со стрептомицином, на котором чувствительная культура не должна расти. После инкубации при 37 С в течение 24 часов определяют частоту трансформации по отношению числа выросших рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного штамма. Например, если при высеве 0,1 мл культуры штамма-реципиента, разведенного до 10–5 микробных клеток, выросло 170 колоний, а при высеве неразведенной взвеси – 68 колоний, частота трансформации в этом случае будет равна:  ,где числитель – содержание рекомбинантных клеток в 1 мл смеси; знаменатель – содержание клеток реципиента в 1 мл культуры сенной палочки. Постановка опыта специфической трансдукции В качестве реципиента берут лактозоотрицательный штамм (E. сoli lac–) без галактозидазного оперона, контролирующего ферментацию лактозы. Трансдуцирующий фаг обозначают как фаг, в геноме которого часть генов замещена β-галактозидазным опероном E.coli. Фаг является дефектным и неспособен вызывать продуктивную инфекцию с лизисом кишечной палочки. На селективной среде Эндо лактозоотрицательные колонии реципиентного штамма образуют бесцветные колонии, в то время как лактозоположительные приобретают красный цвет с металлическим оттенком. Для осуществления специфической трансдукции к 1 мл трёхчасовой бульонной культуры реципиента добавляют 1 мл трансдуцирующего фага в концентрации 106-107 частиц в 1 мл. После чего смесь инкубируют при 37С в течение часа. Затем в зависимости от предполагаемой концентрации бактерий для получения сосчитываемого количества колоний готовят десятикратные разведения. Из пробирки с разведением 10–6 высевают по 0,1 мл на три чашки Петри с селективной средой и равномерно распределяют посев шпателем по её поверхности. После инкубации посевов в течение 24 часов вычисляют частоту трансдукции по отношению количества клеток трансдуктантов, обнаруженных на всех чашках, к числу клеток штамма-реципиента, исходя из того, что каждая колония образовалась в результате размножения только одной бактериальной клетки. Например, если после посева 1 мл смеси реципиента и трансдуцирующего фага в разведении 10-6 на трёх чашках со средой Эндо выросло соответственно 170, 138 и 160 бесцветных колоний, а на первой и третьей пять и одна колония трансдуктантов красного цвета, частота трансдукции будет составлять:  Постановка опыта конъюгации для передачи R – плазмиды, которая контролирует множественную устойчивость к стрептомицину (Strr), тетрациклину (Тсr) и хлорамфениколу (Сmr). В качестве донора используют лейциноотрицательный антибиотикорезистентный штамм кишечной палочки E. coli К12 R+ leu- Strr Tcr Cmr, а реципиент – E. coli К12 R- leu+ Strr TcS CmS. Для постановки опыта в стерильную пробирку вносят по 1 мл 3-часовой бульонной культуры донора и реципиента. После инкубации смеси при 37оС в течение двух часов её высевают в объёме 0,1 мл на чашку с селективной минимальной глюкозосолевой средой и тремя антибиотиками в концентрации по 50 мкг/мл каждого. На данной среде вырастут только рекобинантные колонии (трансконъюганты), которые приобрели резистентность к стрептомицину, тетрациклину и хлорамфениколу. Донорский штамм не вырастет на этой среде потому, что он нуждается в лейцине, а реципиентный штамм – чувствителен к антибиотикам. Частоту формирования трансконъюгантов можно определить по отношению числа рекомбинантных клеток к числу клеток штамма – реципиента рис. 2). Можно привести пример определения частоты формирования трансконъюгантов. Если при высеве 0,1 мл культуры штамма-реципиента в разведении 10-4 на глюкозосолевую среду с лейцином, образовалось 20 колоний, а при высеве 0,1 мл неразведенной смеси – 60 колоний трансконъюгантов, частота их формирования определяется так:  Задания к лабораторному занятию
Тема: Действие факторов внешней среды на микроорганизмы Цель: Знать влияние факторов внешней среды (физических, химических, биологических) на микроорганизмы; владеть вопросами асептики, антисептики, дезинфекции, стерилизации; характеризовать методы стерилизации, уметь определять эффективность дезинфицирующих средств, проводить выделение микробов-антагонистов, бактериофагов и определять их активность. Вопросы для самоподготовки
Литература
Жизнь микроорганизмов находится в тесной зависимости от условий внешней среды. Физические, химические и биологические факторы внешней среды могут оказывать различное влияние на микроорганизмы в зависимости от дозы, времени их воздействия, физиологического состояния и концентрации микробных клеток, среды их обитания. Изучение законов взаимоотношений между миром микробов и окружающей средой имеет большое практическое значение. Действие физических факторов. Среди физических факторов особое значение в жизни микроорганизмов имеет температура. Жизнедеятельность микроорганизмов проявляется только при определенных температурных условиях. Различают три кардинальные температурные точки: минимум, оптимум и максимум. Между нижним и верхним пределами возможна жизнедеятельность микробов, а оптимум соответствует физиологической норме для данного вида. Высокие температуры оказывают губительное действие на микроорганизмы, так как они вызывают коагуляцию белка цитоплазмы микробной клетки. Большинство вегетативных форм бактерий погибает уже при 10-ти минутном воздействии температуры 70ºС и моментально при температуре 100ºС. Большой устойчивостью к высоким температурам обладают бактериальные споры. Они могут сохранять способность к прорастанию даже после многочасового кипячения и только при температуре пара 120ºС и сухого жара 165-170ºС они погибают. На действии высоких температур основан целый ряд методов стерилизации. Высокие дозы излучения убивают большинство патогенных организмов. К ним относятся прямые солнечные лучи, ультрафиолетовые, лучи Рентгена, радия и др. Ультрафиолетовые лучи в диапазоне длины волны от 200 до 280 мкм обладают бактерицидным действием и используются в основном для дезинфекции воздуха. Ультразвуковые волны с частотой колебаний 20000 Гц в сек и больше являются бактерицидными. Ультразвук используют для приготовления вакцин. Аэроионы, заряженные отрицательно, убивают бактерии в концентрациях 5104 в 1 см3 воздуха, аэроионы, несущие положительные заряд, задерживают их рост только в больших концентрациях. Действие химических факторов. Бактерицидное действие химических веществ имеет большое практическое значение, поскольку их используют для дезинфекции, антисептики и в качестве консервантов. Дезинфекция – уничтожение в (на) каком-либо объекте или в окружающей среде патогенных микроорганизмов, вызывающих инфекционные болезни. Цель дезинфекции – прервать пути передачи и распространения инфекционного заболевания. В качестве дезинфицирующих средств применяют галоиды, окислители, фенолы и их производные, тяжелые металлы, кислоты, щелочи, спирты, ПАВ, газообразные вещества. Выбор дезинфицирующего вещества и длительность его воздействия диктуются как особенностями микроорганизма, так и средой, в которой будет происходить контакт дезинфицирующего вещества с патогенным микроорганизмом. Наряду с дезинфицирующими в медицинской практике широко применяются антисептические средства (антисептики). Антисептика обозначает использование химических веществ (антисептиков), убивающих или подавляющих размножение болезнетворных и др. микроорганизмов, находящихся на коже и слизистых оболочках макроорганизма. Антисептика совместно с асептикой широко используются в хирургии. Антисептика – комплекс мероприятий, направленных на предупреждение попадания микроорганизмов на (в) какой-либо объект: операционное поле, бактериологический бокс, определенные производственные помещения, стерильный раствор или препарат. Работа микробиологов, хирургов и многих работников, связанных с изготовлением и использованием лекарственных средств, проводится с применением методов асептиков. Создание асептических условий предусматривает дезинфекцию помещений, стерилизацию инструментов и материалов. Для испытания эффективности действия дезинфицирующих средств применяют метод – ”тест-объектов”. Приготовление бактериальных тестов производят следующим образом: выстиранная белая хлопчатобумажная ткань обрабатывается спиртом в течение 30 мин. Ткань, обеззараженную таким образом, прополаскивают, сушат, проглаживают, разрезают на правильные прямоугольники длиной в 1 см, шириной 0,5 см, укладывают по 20-30 шт. в чашки Петри и стерилизуют. Тесты заражают 2-миллиардной микробной взвесью, для чего используют смывы односуточной агаровой культуры стафилококка, кишечной палочки и антракоида (с большим содержанием спор). Стерильные кусочки ткани погружают в микробную взвесь на 20-25 минут, после этого извлекают стерильным пинцетом, просушивают между листами стерильной фильтрованной бумаги, а затем 15-20 минут в термостате. Тесты помещают в пробирки, содержащие по 5 мг дезинфектантов и выдерживают от 5 минут до часа. После этого их дважды промывают в стерильной воде, погружают в пробирку с питательным бульоном и ставят в термостат (для стафилококка и кишечной палочки на 6-8 дней, для антракоида на 21 день). Помутневший бульон высевают на питательный агар. Для каждой экспозиции используют не менее 3 тестов. Контрольные тесты не обрабатываются дезинфицирующими веществами. Консерванты – это вещества, обладающие антимикробным действием, которые добавляют в лекарственные средства для предотвращения роста и развития микроорганизмов, попадающих в них во время технологического процесса или при неоднократном употреблении препарата. Консерванты вводят как в стерильные препараты (парентеральные, офтальмологические и некоторые другие), так и в нестерильные лекарственные средства. Для максимальной защиты пациента эффективная концентрация консерванта в готовом препарате должна быть значительно ниже токсичной для человека дозы. Испытание состоит из искусственного заражения лекарственного средства суспензиями определенных тест-микроорганизмов, инкубации контаминированных образцов при определенной температуре, отбора проб через указанные интервалы времени и подсчета жизнеспособных клеток микроорганизмов в 1 г или в 1 мл препарата на протяжении периода испытания. Предлагаемый метод определения эффективности консервантов применяется для готовых лекарственных средств в неповрежденной упаковке. Все лекарственные средства, в которые вводятся консерванты, разделены на две категории (Таблица 1). Категория 1 – водорастворимые лекарственные средства, различающиеся по методу применения. Категория 2 – нерастворимые в воде лекарственные средства. Тест-микроорганизмы. Антимикробное действие консервантов определяют в отношении некоторых видов бактерий и грибов, которые являются наиболее частыми контаминантами лекарственных средств: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ГИСК 453 (взамен АТСС 9027), Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р, Candida albicans NCTC 885-653, Aspergillus niger BKM F-1119. Примечание:
Подготовка тест-штаммов. Все культуры микроорганизмов, полученные из Государственных музеев, следует оживлять согласно прилагаемым инструкциям. По рекомендациям Государственного музея патогенных бактерий (ГИСК им. Л.А.Тарасевича) тест-штаммы хранят при температуре 5±10 ºС в лиофилизированном состоянии или под слоем стерильного вазелинового масла на среде Романова следующего состава: панкреатического гидролизата казеина – 8,0 г, натрия хлорида – 5,0 г, агар-агара – 10,0 г, воды дистилированной – 1000 мл, рН после стерилизации 7±0,1. Тест-штаммы бактерий из ампул с лиофилизированной культурой или со среды хранения высевают в пробирки с питательным бульоном и инкубируют посевы при температуре от 30 до 35 ºС в течение 18-24 ч. После 2-х, 3-х пассажей с бульона на бульон культуру пересевают бактериологической петлей штрихом на питательный агар в чашках Петри для получения изолированных колоний. Условия выращивания тест-микроорганизмов приведены в таблице 2. Выросшую на питательном агаре культуру каждого тест-штамма проверяют визуально на чистоту роста, изучают культурально-морфологические и биохимические свойства. Типичные колонии пересевают в пробирки на скошенный агар того же состава и инкубируют, как было указано выше. Культуры грибов C.albicans и A.niger хранят при температуре 5±10 ºС на скошенном агаре Сабуро, делая пересевы каждые 3 месяца. Приготовление инокулята. Выросшие культуры тест-штаммов бактерий и C.albicans смывают с поверхности скошенного агара стерильным 0,9% раствором натрия хлорида. Концентрацию клеток бактерий и C.albicans доводят до 10 единиц в 1 мл, используя отечественный стандартный образец мутности ОСО 42-28-59-85 или международный стандарт мутности (The International Reference Preparation of Opacity of 10 International Units). Можно для этой цели использовать инструментальный турбодиметрический метод. Для смыва конидий A.niger используют стерильный 0,9% раствор натрия хлорида, содержащий 0,05% Твина-80. Количество конидий A.niger в 1 мл смыва определяют с помощью камеры Горячева. Полученную взвесь разводят до концентрации 1x109 конидий в 1 мл. Стандартизованные суспензии всех тест-штаммов разводят до 1x108 КОЕ/мл (КОЕ – колониеобразующая единица). Техника испытания. Отбирают препараты в конечной, неповрежденной упаковке. В 5 стерильных флаконов помещают по 20 мл исследуемого препарата. В каждый флакон вносят по 0,1 мл одного из приготовленных инокулятов тест-микроорганизмов – E.coli, P.aeruginosa, S.aureus, C.albicans, A.niger – и перемешивают. Лекарственные средства, нерастворимые в воде (Категория 2), контаминируют так же, как и водорастворимые препараты, из расчета конечной концентрации тест-микроорганизма 1x105 – 1x106 КОЕ в 1 мл или 1 г. Препараты, приготовленные на твердой мазевой основе, нагревают до температуры от 45 до 50 ºС. Используя стерильные стеклянные бусы или шпатель, смешивают каждый инокулят стандартизованной микробной суспензии с образцом препарата в течение не менее 1 минуты до достижения гомогенной эмульсии. Для улучшения смешивания можно добавить стерильное поверхностно-активное вещество, если оно не влияет на жизнеспособность микроорганизмов или на эффективность консерванта. Фактическую исходную концентрацию тест-микроорганизмов в контаминированных образцах определяют сразу после контаминации чашечным агаровым методом посева на соответствующие питательные среды, используя подходящие разведения для получения на чашке от 30 до 300 колоний бактерий и от 10 до 100 колоний грибов. Можно также применять для этой цели метод мембранной фильтрации. Контаминированные образцы препарата выдерживают при температуре от 20 до 25 ºС в защищенном от света месте. Через 7, 14 и 28 суток после инокуляции определяют количество жизнеспособных микроорганизмов в 1 мл образца. Результаты испытания и их интерпретация. Чашечным агаровым методом определяют количество КОЕ/мл для каждого тест-микроорганизма через указанные выше сроки инкубации контаминированного препарата. Выражают в десятичных логарифмах изменение количества микробных клеток по сравнению с исходной концентрацией в 1 мл. Для оценки эффективности антимикробного действия консервантов используют критерии, указанные в таблице 3. Действие биологических факторов. Микробный антагонизм. Во внешней среде микроорганизмы существуют в виде сложных ассоциаций. Они постоянно вступают друг с другом в сложные взаимоотношения, которые могут носить характер взаимопомощи-симбиоза или антагонизма. Антагонизм может проявляться в бактериостатическом, бактериолитическом или бактериоцидном действии. Проявления и механизм микробного антагонизма могут быть весьма различными. Антагонизм может быть обусловлен прямым воздействием микроорганизмов друг на друга или действием их продуктов обмена. Антимикробным действием могут обладать различные неспецифические продукты обмена микробной клетки: кислоты, щелочи, спирты, перекиси, сероводород и др. соединения. Эти вещества действуют на микробную клетку неспецифически. Наибольший интерес представляют вырабатываемые микроорганизмами химические вещества, обладающие специфическим антимикробным действием, то есть действующим только на определенные виды микроорганизмов. Для суждения об активности бактериофага определяют его титр. Титром фага называется его предельное разведение, вызывающее полный лизис соответствующей культуры. Определение титра фага можно производить на жидких и плотных питательных средах. Выделение микробов-антагонистов из почвы производят методом ”скученных пластинок”. С этой целью густую взвесь почвы сеют на поверхность мясо-пентонного агара в чашки Петри. На фоне скученного роста более отчетливо проявляется действие микробов-антагонистов и микробов-синергистов. Вокруг первых колоний наблюдаются зоны задержки роста, вокруг вторых – пышный рост бактерий. Микробы-антагонисты и продукты их жизнедеятельности практически используют для угнетения или задержки роста гнилостных и патогенных бактерий. Микробы-антагонисты встречаются среди грибов (пенициллы, аспергиллы) и среди бактерий. Выраженными антагонистическими свойствами обладают кишечная и синегнойная палочки, молочнокислые бактерии. Так синегнойная палочка является антагонистом брюшно-тифозной и дифтерийной палочек, холерного вибриона, гнилостные бактерии-антагонисты сибиреязвенной палочки. Испытание активности микроба-антагониста производится следующим образом. Засевают густым газоном две чашки Петри с мясо-пентонным агаром культурами кишечной палочки и стафилококка. Для этого 2-3 капли бульонной культуры этих микроорганизмов тщательно растирают по поверхности агара при помощи стерильного шпателя. На поверхность засеянных чашек накладывают кусочек агаровой культуры актиномицета-антагониста. Чашки помещают в термостат. Вокруг наложенного кусочка культуры актиномицета-антагониста наблюдается зона, свободная от роста испытуемого микроба. Бактериофагия. Бактериофаг является вирусом, паразитирующим в бактериальной клетке и вызывающим ее лизис. Фаги широко распространены в природе и встречаются всюду, где имеются бактерии. В природе существует огромное количество фагов строго специфичных в отношении определенных видов бактерий. Бактериофаги можно обнаружить в различных объектах внешней среды, например, сточных водах, испражнениях и др. Феномен бактериофагии может быть изучен на жидких и плотных средах. Наиболее показательное проявление бактериофагии – это полное просветление бульонной культуры, наступающее вследствие лизиса бактерий. При нанесении бактериофага на агаровую культуру наблюдается образование так называемых негативных колоний или стерильных пятен. Метод выделения бактериофага. Берут 1-2 г испражнений или др. материала, размешивают в 50 мл МПБ и ставят в термостат на 18-24 часа при 37ºС. После этого смесь для очищения от грубых частиц фильтруют через асбестовые пластинки Зейтца. Литическую силу фильтрата по отношению к той или иной культуре микроорганизмов испытывают несколькими способами.
Для суждения об активности бактериофага определяют его титр. Титром фага называется его предельное разведение, вызывающее полный лизис соответствующей культуры. Определение титра фага можно производить на жидких и плотных питательных средах. Метод титрования бактериофага в жидкой питательной среде. Необходимо приготовить ряд пробирок, содержащих по 4,5 мл МПБ. В первую пробирку стерильной пипеткой вносят 0,5 мл исходного бактериофага (разведение 1:10). Из первого разведения новой стерильной пипеткой 0,5 мл переносят во 2-ю пробирку (разведение 1:100). И таким образом проводят разведение в девяти пробирках. Десятую пробирку оставляют для контроля, т.е. она не должна содержать фага. Во все пробирки, включая контрольную, вносят по одной капле бульонной культуры микроорганизма. Пробирки термостатируют 18-24 часа и после этого производят учет результатов. Стерилизация. Методы стерилизации. Стерилизация – это процесс умерщвления в объекте или удаления из него микроорганизмов всех видов, находящихся на всех стадиях развития. Для стерилизации используют следующие методы:
Термические методы стерилизации. Паровой метод стерилизации осуществляют насыщенным водяным паром при избыточном давлении 0,11 Мпа (1,1 кгс/см2) и температуре 120ºС; 0,20 Мпа (2 кгс/см2) и температуре 132ºС. Стерилизацию проводят в паровых стерилизаторах – автоклавах. Совместное действие высокой температуры и пара обеспечивает высокую эффективность данного способа. При этом погибают вегетативные клетки и споры микроорганизмов. Стерилизация паром при температуре 120ºС рекомендуется для растворов лекарственных веществ. Время стерилизационной выдержки зависит от физико-химических свойств препарата, объема раствора и используемого оборудования.
Жиры и масла в герметично укупоренных сосудах стерилизуют при 120ºС в течение 2 ч. Этим методом стерилизуют также изделия из стекла, фарфора, металла, перевязочные и вспомогательные материалы (вата, марля, бинты, фильтрованная бумага, спецодежда и др.). Время стерилизационной выдержки при температуре 120ºС – 45 мин, при 132ºС – 20 мин. Для стерилизации изделий из резины следует использовать первый из указанных режимов. Воздушный метод стерилизации осуществляют сухим горячим воздухом в воздушных стерилизаторах при температуре 160, 180 или 200ºС. Эффективность этого метода стерилизации зависит от температуры, времени, степени теплопроводности стерилизуемых объектов и правильности расположения их внутри стерилизационной камеры для обеспечения свободной циркуляции горячего воздуха. Воздушный метод используют для стерилизации термостойких порошкообразных веществ (натрия хлорида, окиси цинка, талька, белой глины и др.).
Изделия из стекла, металла, силиконовой резины, фарфора, установки для стерилизующего фильтрования с фильтрами и приемники фильтрата стерилизуют при 180 ºС в течение 60 мин. или при 160 ºС в течение 2,5 час. Прокаливанием на пламени стерилизуют бактериальные петли, пинцеты, предметные стекла и некоторые мелкие инструменты (иглы, крючки, лопаточки). Температура пламени горелки достигает 1560 ºС. При прокаливании происходит сгорание микроорганизмов и их спор. Кипячение – простейший способ стерилизации игл, шприцев, хирургических инструментов, резиновых трубок. Для этого применяют специальные стерилизаторы для инструментов. Стерилизацию проводят в течение 20-30 мин. Для устранения жесткости воды и повышения температуры кипения в воду полезно добавить 1-2% бикарбоната натрия. Однако следует помнить, что споры некоторых бацилл и вирусные частицы (возбудитель гепатита) могут выдерживать кипячение в течение нескольких часов. Стерилизацию текучим паром применяют в тех случаях, когда стерилизуемый материал изменяет свои свойства при температуре выше 100ºС. таким способом стерилизуют растворы, содержащие углеводы, витамины, молоко и др. используют автоклав с незакрепленной крышкой и открытым паровыпускным краном или специальный аппарат Коха. Поскольку при 100 ºС многие споровые формы сохраняют свою жизнеспособность, прибегают к дробной стерилизации, нагревая стерилизуемый материал текучим паром при 100 ºС 30 минут 3 раза через каждые 24 ч с выдерживанием стерилизуемых объектов между стерилизациями при 18-37 ºС. за это время споровые формы микробов прорастают и превращаются в вегетативные, которые погибают при повторных прогревах. Тиндализация – вид дробной стерилизации, который применяют к объектам, содержащим вещества, разлагающиеся и денатурирующие при 100ºС (витамины, некоторые глазные капли, питательные среды). При этом нагревают стерилизуемый объект на водяных банях с терморегуляторами при 60-65 ºС 5 раз или при 70-80 ºС 3 раза по 60 мин с выдерживанием между стерилизациями при температуре 18-37 ºС. недостаток дробной стерилизации – возможность образования спор вегетативными клетками, образовавшимися из проросших спор. Химические методы стерилизации. Метод рекомендуется для изделий из полимерных материалов, резины, стекла, коррозионно-стойких материалов. Для газовой стерилизации используют окись этилена или ее смесь с различными флегматизаторами: бромистым метилом, двуокисью углерода, хладонами (фреонами) и др. Cтерилизацию проводят в газовых стерилизаторах или микроанаэростатах при следующих режимах: - окись этилена – стерилизующаяся доза 1200 мг/дм3, температура стерилизации не менее 18 ºС, относительная влажность 80%, время стерилизационной выдержки- 16 ч (микроанаэростат); - смесь ОБ (смесь окиси этилена и бромистого метила в весовом соотношении 1:2,5); а) стерилизующая доза 2000 мг/дм3, температура стерилизации 55ºС, относительная влажность 80%, время стерилизационной выдержки – 4 ч; б) стерилизующая доза 2000 мг/дм3, температура стерилизации не менее 18ºС, относительная влажность 80%, время стерилизационной выдержки – 16 ч при той же относительной влажности (микроанаэростат) В связи с токсичностью окиси этилена и бромистого метила применение стерилизованных этими газами изделий допускается только после их дегазации, т. е. выдержки в вентилируемом помещении до допустимых остаточных количеств, указанных в НТД. Для химической стерилизации растворами используют перекись водорода и надкислоты. При стерилизации 6% раствором перекиси водорода температура стерилизующего раствора должна быть не менее 18ºС, время стерилизационной выдержки – 6 ч; при температуре 50ºС – 3 ч. При стерилизации 1% раствором дезоксана-1 ( по надуксусной кислоте) температура стерилизующего раствора должна быть не менее 18ºС, время стерилизационной выдержки – 45 мин. Химическую стерилизацию растворами проводят в закрытых емкостях из стекла, пластмассы или емкостях, покрытых неповрежденной эмалью, при полном погружении изделия в раствор на время стерилизационной выдержки. После этого изделие должно быть промыто стерильной водой в асептических условиях. Стерилизация фильтрованием. Растворы термолабильных веществ (растворы белков, сыворотки, некоторые витамины и др.) стерилизуют фильтрованием с помощью мембранных и глубинных фильтров, задерживающих микроорганизмы и их споры. Мембранные фильтры характеризуются ситовым механизмом задержания и постоянным размером пор при эксплуатации. Максимальный диаметр пор стерилизующего фильтра не превышает 0,3 мкм. Мембранные фильтры изготавливаются из эфиров целлюлозы (ацетилцеллюлозы, этицеллюлозы, нитроцеллюлозы ) и их смесей, а также из политетрафторэтилена (тефлона), поливинилхлорида, акрила, нейлона и др. полимеров. Глубинные фильтры изготовляют из волокнистых материалов (хлопок, шерсть, стекловолокно, смесь целлюлозы и асбеста и др.). эти фильтры имеют толщину 2-6 мм и удерживают микроорганизмы и частицы за счет адсорбционного, ситового и инерционного механизмов. Глубинные фильтры могут быть использованы для стерилизации растворов, в том числе содержащих микробные тела размером 0,3 мкм. Задержанные в глубине фильтра микроорганизмы могут прорастать в процессе длительной фильтрации и попадать затем в фильтруемый раствор. Кроме того, возможен отрыв волокон фильтра и загрязнение ими фильтра. Особенно опасны в этом отношении фильтры из асбеста и стекловолокна, поэтому такие фильтры не должны применяться для стерилизации лекарственных средств, вводимых парентерально. Стерилизацию фильтрованием и разлив раствора проводят в асептических условиях. В лабораторной практике широко применяется фильтрация материала с помощью фильтра Зейтца (асбестовые фильтры). Эти фильтры помещают в разъемную часть цилиндрической воронки Зейтца, обе части которой скрепляются барашкообразными болтами. Трубчатый конец воронки через резиновую пробку вставляют в колбу Бунзена. Собранная система с асбестовым фильтром стерилизуется в автоклаве. Фильтруемую жидкость наливают в металлический цилиндр аппарата, а из колбы приемника откачивают воздух, под влиянием разности давлений жидкость проходит через фильтр. Радиационный метод стерилизации. Радиационный метод стерилизации может быть рекомендован для изделий из пластмасс, изделий одноразового использования в упаковке, перевязочных материалов, некоторых лекарственных средств и др. Облучение объектов в конечной упаковке производят на гамма-установках, ускорителях электронов и др. источниках ионизирующего излучения дозой 25 кГр или др. дозами в зависимости от конкретных условий. Задания к лабораторному занятию
РАЗДЕЛ: ”ХИМИОТЕРАПИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ”. Цель: Дать общую характеристику химиотерапевтических препаратов, знать предъявляемые к ним требования, изучить основные группы химиопрепаратов, ознакомиться с классификациями антибиотиков, проявлениями микробного антагонизма. Изучить побочное действие химиотерапевтических препаратов и антибиотиков; меры профилактики при лечении инфекционных процессов. Освоить методы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным химиотерапевтическим препаратам. Вопросы для самоподготовки
Литература
Идеальным требованием для рациональной и целенаправленной терапии бактериальных инфекций является тщательная бактериологическая диагностика заболевания с выделением, идентификацией возбудителя и определением его чувствительности к назначаемому препарату. Оправданность такого подхода диктуется необходимостью выбора наиболее эффективного препарата среди многих близких по спектру действия, а также возможной устойчивостью микроорганизмов к назначаемым антибиотикам. Это особенно важно в связи с широким распространением антибиотикоустойчивых штаммов различных микроорганизмов. Для определения чувствительности микробов к антибактериальным химиопрепаратам существует ряд методов, среди которых наиболее распространены: метод последовательных разведений в жидкой питательной среде или питательном агаре, метод диффузии в агар (метод дисков, насыщенных антибиотиками) и ряд ускоренных методов. Определение чувствительности микробов к антибактериальным химиопрепаратам in vitro проводится в условиях, значительно отличающихся от тех, в которых препарат действует в организме. На его результаты большое воздействие оказывают такие факторы, как состав и рН питательной среды, величина посевной дозы, возраст культуры, условия культивирования и др. При использовании метода диффузии в агар на результаты исследований влияют толщина слоя питательной среды, её влажность, скорость диффузии препаратов, скорость роста исследуемых микроорганизмов и др. Питательные среды для определения чувствительности микробов к антибактериальным химиопрепаратам Среды для определения чувствительности должны отвечать следующим требованиям:
Взятие проб. Материал для посева из горла, ран, язв следует брать стерильным ватным тампоном. Экссудат из полостей (плевры, брюшной полости, суставов, абсцессов) набирают стерильным шприцем. Кровь из вен желательно брать в период пика температурной кривой. При взятии проб мочи следует соблюдать условии асептики. В исследовании используют осадок, полученный при центрифугировании мочи. Выделение чистых культур и идентификация микробов производится по правилам бактериологической техники. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом “бумажных дисков” Этот метод является наиболее простым, быстрым, доступным и широко используемым, его проводят, прежде всего, для оценки эффективности антибиотиков в клинических условиях. Он является качественным методом, позволяющим установить лишь факт чувствительности или устойчивости возбудителя инфекции к данному антибиотику. Определение чувствительности проводят с чистыми культурами бактерий, однако, в ряде случаев с целью быстрого получения ориентированных данных о чувствительности микроорганизмов для исследования используют непосредственно патологический материал. Питательную среду разливают в чашки Петри, помещённые на строго горизонтальной поверхности, заполнив их на одинаковую высоту 4 мм (25 мл среды для чашек с внутренним диаметром 9 см). Перед посевом поверхность среды должна быть подсушена для того, чтобы посевной материал мог легко всасываться. Взятый тампоном материал для исследования помещают в стерильную пробирку, в которую добавляют 1,5 мл физиологического раствора или бульона, встряхивают для получения смыва. Клинический материал или культуру микроорганизма, выделенную от больного, засевают на поверхность застывшего агара в чашку Петри, равномерно распределяют путем покачивания чашки. Избыток жидкости удаляют пипеткой. Чашки подсушивают в течение 30-40 мин. при комнатной температуре. После впитывания жидкости в агар на него прокаленным пинцетом накладывают диски, слегка придавливая, на равномерном расстоянии друг от друга и на расстоянии 2 см от края чашки. На одну чашку помещают 6 дисков. Диски представляют собой небольшие кружки диаметром 6 мм, сделанные из специального картона, пропитанные определённым количеством разных антибиотиков. Содержание антибиотиков в диске, указанное на этикетке, соответствует рекомендациям ВОЗ. После наложения дисков чашки выдерживают при комнатной температуре в течение 30 минут. Чашки помещают в термостат на 18-24 часа при температуре 37 ºС в перевернутом кверху дном положении, после чего учитывают результаты. Если испытуемая микробная флора чувствительна к одному из антибиотиков, вокруг соответственного диска образуется зона задержки роста и тем большая, чем сильнее действие антибиотика. Измеряют диаметры зон задержки роста микробов вокруг дисков, включая диаметр самих дисков, с помощью линейки или измерителя с точностью до 1 мм. Единичные колонии или тонкая плёнка роста внутри зоны задержки роста не учитываются. Отсутствие зоны задержки роста микроба вокруг диска свидетельствует о том, что испытуемый штамм не чувствителен к данному антибиотику. При зоне задержки роста микроба диаметром до 10 мм, штамм расценивается как малочувствительный. Зона задержки роста микроба более 10 мм указывает на чувствительность штамма. Чем больше зона задержки роста микроба более 10 мм указывает на чувствительность штамма. Чем больше зона задержки роста, тем выше чувствительность микроорганизмов к антибиотику. В ответе должно быть написано, какой чувствительностью обладает исследуемая культура, а не размер зоны задержки роста. Для терапии данной инфекции рекомендуют те антибиотики, вокруг дисков, которых получены наибольшие зоны задержки роста. |