Общая микробиология. Виды микроскопии назначение и принципы применения
 Скачать 1.57 Mb.
|
Методы культивирования анаэробных микроорганизмовВыращивание анаэробов более сложно, чем культивирование аэробных микроорганизмов. Для выращивания анаэробов необходимо создать определённые условия, сущность которых заключается в удалении молекулярного кислорода из питательной среды и внешнего. Другим обязательным условием, обеспечивающим выделение анаэробов из исследуемого материала, является внесение большого количества посевного материала в питательную среду. Для культивирования анаэробов применяют физические, химические и биологические методы. Физические методыКипячение среды – наиболее простой способ удаления растворенного в ней кислорода. Для этого непосредственно перед посевом материала пробирки с питательными средами кипятят на водяной бане в течение 10-20 мин, в результате чего из среды вытесняется воздух и, следовательно, удаляется кислород. Свежепрокипячённую среду быстро охлаждают под струёй холодной воды, чтобы не произошло насыщение ее кислородом воздуха. Среду засевают материалом и заливают сверху вазелиновым маслом. Посев в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества В качестве редуцирующих веществ используют глюкозу, аскорбиновую кислоту, цистеин. Активно связываются с кислородом воздуха животные ткани паренхиматозных органов (печени, селезенки). Можно применять и ряд неорганических восстановителей: сульфиды, сероводород, цитрат титана. Редуцирующие вещества должны вводиться в концентрациях, не угнетающих рост микроорганизмов. На свойстве животных клеток поглощать кислород основано применение сред: Китта-Тароцци. Эта среда широко применяется для культивирования анаэробов. В её состав входят: мясо-пептониый бульон, печень животного (обычно говяжья). Бульон сверху заливают слоем вазелинового масла и стерилизуют в автоклаве или 0, 5 атм. -30мин. Среду Вильсона-Блера готовят из мясо-пептонного агара к которому добавляют глюкозу, Na2SОз, хлористое железо-- FeC1з. На этой среде анаэробные микроорганизмы, возбудители газовой анаэробной инфекции, столбняка, ботулизма растут в глубине агара. При этом осуществляется восстановление сернистокислого натрия до сернистого, последний же вступает в реакцию с хлорным железом, переводя его в сернистое железо, имеющее черный цвет. Наблюдается в пробирках и разрыв среды, свидетельствующий об газообразовании. Метод Вейон-Виньяла Заключается в том, что расплавленный в пробирке и охлаждённый до 50 ° питательный агар засевают исследуемым материалом, тщательно перемешивают и натягивают его в пипетку Пастера. После застывания среды запаивают пипетку с обоих концов или заливают концы парафином и помещают в термостат. Внутри трубки развиваются отдельные колонии анаэробов. Для выделения колонии трубку надрезают напильником, соблюдая правила асептики, на уровне колонии, ломают, а колонию захватывают стерильной петлёй и переносят в пробирку с питательной средой для дальнейшего выращивания и изучения в чистом виде. Создание вакуума в специальных аппаратах (анаэростатах) Вакуумные условия для выращивания анаэробов создают в анаэростате. Анаэростаты - это воздушные эксикаторы, они представляют собой металлические цилиндрические сосуды с герметически закрывающейся крышкой. Они снабжены манометром, который показывает степень разряженности воздуха и краном для присоединения к вакуумному насосу Из анаэростата вакуумным насосом откачивается воздух. Анаэростаты способны сохранять высокие разряжение в течение длительного времени. Пробирки и чашки Петри с анаэробными микроорганизмами сразу после посева помещают в анаэростат. Колонии анаэробов в вакуумных условиях растут на поверхности плотной питательной среды. Химический методМетод Аристовского Материал, исследуемый на наличие анаэробов, засевают на среду в чашки Петри и помещают их в эксикатор, на дно которого кладут химический поглотитель кислорода: гидросульфит натрия или пирогаллол. В расширенную часть сосуда устанавливают на подставке чашки с посевами. Прибор помещают в термостат при температуре 37 °С на 24-48 часов. Биологический методВ почве, воде, человеческом и животном организме анаэробы постоянно встречаются с аэробами. При этом аэробы, поглощая необходимый для их жизни кислород, создают условия, благоприятствующие развитию анаэробных микроорганизмов. Тот же принцип лежит в основе биологических методов культивирования анаэробов в лабораторной обстановке. Для этого используют метод Фортнера. В чашку Петри наливают толстым слоем питательный агар. Когда агар застынет посредине чашки стерильным скальпелем вырезают бороздку шириной 1-1,5 см. Затем одну половину среды засевают культурой аэроба, а другую - анаэробной культурой. Щель между дном и крышкой чашки промазывают вакуумной смазкой или заливают парафином. Затем чашку помещают в термостат. Быстрорастущие аэробы поглощают находящийся в чашке кислород и создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробов. Задания к лабораторному занятию
Таблица Биохимическая активность бактерий
Приготовление мазков из культуры анаэробов со среды Китта-Тароцци и молока под маслом имеет свои особенности. Пробирку со средой наклоните под углом 30-35 градусов. Возьмите стерильную пастеровскую пипетку, закройте указательным пальцем с тупого конца и отпустите под слой вазелинового масла в нижнюю часть среды, после чего откройте пипетку, сняв с нее палец. Поднявшейся по капилляру жидкости будет достаточно для приготовления мазка. Не меняя наклона пробирки, выведите капилляр из среды. Мазок сделайте обычным способом. Окрасьте по Граму.
Для этого наберите в пастеровскую пипетку 0,2-0,5 мл почвенной суспензии и внесите ее в пробирку со средой Китта-Тароцци (среда накопления), поместите в термостат на 18-24 час при 37ºС. Учтите на следующем занятии изменения, происшедшие в среде, а именно: помутнение, газообразование. Оформите протокол. Тема: Культивирование вирусов Цель: ознакомление с методами культивирования вирусов | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||