Общая микробиология. Виды микроскопии назначение и принципы применения
 Скачать 1.57 Mb.
|
Характер роста микроорганизмов на жидких питательных средахХарактер роста микроорганизмов в жидких питательных средах менее разнообразен, чем на плотных. Различают:
Второй этап выделения чистой культуры
Задания к лабораторному занятию
Отметьте: А) диффузное помутнение среды Б) осадочный рост В) образование пленки Г) пристеночный рост
Чашку поверните дном к себе и рассмотрите колонии в проходщем свете. Найдите три разных типа колоний, пронумеруйте их и опишите. Обратите внимани на следующие свойства: А) величину колоний Б) цвет колоний (наличие пигмента) В) форму колоний Г) поверхность Д) характер кра колонии Е) консистенцию Таблица
Обратите внимание на размер, форму бактерий и их окраску. Сделайте зарисовки в альбом.
При пересеве колонии на скошенный агар нужно бактериологической петлей брать культуру только из отмеченной, изученной ранее колонии, не задевая ближайших. Засенную пробирку подпишите и поставьте в термостат на 18-24 ч. Оформите протокол. Тема: Ферменты бактерий. Методы изучения ферментативной активности бактерий и их использование для идентификации бактерий. Цель: Охарактеризовать ферментативную. Вопросы для самоподготовки
Литература
В жизнедеятельности микробов ферменты играют большую роль. Они являются обязательными участниками разнообразных биохимических реакций, лежащих в основе функций дыхания, питания, размножения. Микроорганизмы обладают большим разнообразием ферментов. Они или просто связаны с клеточными структурами бактерий, или растворимы и легко извлекаются из клетки. Основной составной частью ферментов является белок. Являясь биологическими катализаторами, ферменты обеспечивают течение в бактериальных клетках биохимических реакции, без которых невозможно их развитие. Кроме того, выделяясь во внешнюю среду, ферменты разлагают сложные органические вещества на более простые компоненты, удобные для усвоения бактериальной клеткой. Выделяемые бактериями во внешнюю среду ферменты обусловливают биохимическую активность бактерий, причем качественная сторона биохимической активности бактерий всегда строго специфична для данного вида бактерий. Биохимическая активность микробов установилась под влиянием внешних условий в процессе их эволюционного развития. В связи с этим большей биохимической активностью обладают сапрофитные бактерии, приспособившиеся жить за счет мертвых органических субстратов внешней среды, для расщепления которых необходимы все группы ферментов. Патогенные бактерии обладают меньшей биохимической активностью, имея в своем составе лишь строго определенные ферменты. Каждый вид микроорганизмов продуцирует постоянный для него набор ферментов, одни из которых расщепляют в разной степени белки и углеводы, а другие вызывают окисление и восстановление различных субстратов. Относительная стабильность ферментных систем бактерий позволяет использовать биохимические свойства бактерий в сочетании с их морфологическими, культуральными и другими постоянньми признаками для определения видов и типов бактерий, выделяемых из организма больного при инфекционных заболеваниях. В микробиологической практике для обнаружения ферментов исследуемую культуру микробов засевают на специальные диагностические среды (см. стр. ). В условиях практической микробиологической лаборатории наиболее часто производят изучение сахаролитических и протеолитических ферментов. Сахаролитические ферменты микробов Способность расщеплять различные углеводы с образованием кислот, альдегидов и газообразных продуктов характерна для значительного количества бактерий. Разнообразие ферментативных реакций у отдельных родов и видов бактерий позволяет использовать это в дифференциально-диагностических целях для идентификации исследуемых культур. Свойство одних бактерий расщеплять данный углевод и его отсутствие у сравниваемых бактерий иногда является основным признаком, пользуясь которым, возможно дифференцировать возбудитель заболевания. Среды, используемые для определения сахаролитической активности бактерий состоят из трех основных компонентов:
Для обнаружения сахаролитических ферментов исследуемую культуру бактерий засевают в питательные среды Гисса, называемые также “пестрым рядом”. “Пестрый ряд” Гисcа содержит 5 пробирок: с глюкозой, лактозой, манитом, мальтозой и сахарозой. Название “пестрый ряд” обусловлено тем, что под действием ферментов микроба, одни углеводы остаются неизменными, и, следовательно, цвет питательной среды не меняется, в то время как микробы другого вида расщепляют сахара, образуя кислые продукты распада, которые изменяют цвет индикатора и, соответственно, цвет питательной среды. Для обнаружения газов, являющихся конечными продуктами распада сахаров, в пробирки с жидкими средами Гисса опускают “поплавок ” – трубочку диаметром 0,5-0,7 см, запаянную с одного конца. При образовании в среде газообразных продуктов, поплавок всплывает на поверхность среды. Данные свойства микроорганизмов широко используют для диагностики инфекционных болезней. Так, например, кишечная палочка, являющаяся постоянным обитателем кишечника человека, морфологически идентична возбудителю брюшного тифа, но в отличие от него, ферментирует среды Гисса с образованием кислоты и газа, в то время как возбудитель брюшного тифа ферментирует их без газа. Таблица Дифференциально-диагностическая таблица кишечно-тифозной группы
Примечание: + – наличие подвижности, ферментации – – отсутствие подвижности к – образование кислоты кг – образование кислоты и газ Протеолитические ферменты микробов Белковые молекулы, находящиеся в среде, не проникают внутрь бактериальной клетки. Естественно, что бактерии должны обладать механизмом, обусловливающим внеклеточное расщепление белка до более мелких молекул, пригодных для ассимиляции. Некоторые виды микроорганизмов продуцируют и выделяют во внешнюю среду протеолитические ферменты – протеазы. катализирующие расщепление белков. В результате расщепления молекулы белка образуются высокомолекулярные промежуточные продукты распада – пептоны, альбумозы и полипептиды. Под действием других протеолитических ферментов пептоны в свою очередь расщепляются на полипептиды (соединение двух или нескольких аминокислот и отдельные аминокислоты). Для выявления протеолитических ферментов исследуемую культуру микроба засевают в питательную среду, содержащую 10-20% желатина. Посевы инкубируют при температуре 20-22ºС в течении нескольких дней. При наличии протеолитических ферментов бактерии разжижают столбик питательной среды с желатином, причем в зоне контакта образуется фигура, напоминающая воронку или елочку. Для патогенных микроорганизмов разжижение желатина является диагностическим признаком. Определение индола в культуре микроорганизмов Некоторые виды патогенных микробов с выраженной протеолитической активностью обладают способностью расщеплять белок и пептон до продуктов глубокого распада в виде индола и сероводорода. Индол образуется при расщеплении сложной гетероциклической кислоты – триптофана. Для выявления индолообразования петлю исследуемой культуры засевают в среду Строгова. Тотчас после посева в пробирку вносят полоску индикаторной бумаги, пропитанную раствором щавелевой кислоты так, чтобы индикаторная бумага не касалась питательной среды. Для этого верхнюю треть бумажной полоски прижимают пробкой к стенке пробирки. Посевы инкубируют 24-28 ч. при температуре 37ºС. Образование индола определяют по окрашиванию нижнего конца индикаторной бумаги в бледно-розовый цвет, хорошо заметный в проходящем свете. Определение сероводорода Сероводород является конечным продуктом расщепления серусодержащих аминокислот: цистина, цистеина и метионина. Петлю исследуемой культуры микробов засевают в пробирку с мясопептонным бульоном. Тотчас после посева в пробирку вносят пропитанную ацетатом свинца полоску индикаторной бумаги. В положительных случаях образующийся в культуре сероводород вступает в соединение с бесцветным ацетатом свинца и превращается в сульфат свинца, который придает индикаторной бумаге черно-бурое окрашивание. Окончательный учет результатов на образование индола и сероводорода проводят на 7-10 день после посева, так как процесс ферментативного расщепления белка и образование конечных продуктов распада происходит в течение длительного времени. Третий этап выделения чистой культуры.
Задания к лабораторному занятию
Визуально чистая культура характеризуется однородным ростом. При микроскопическом исследовании окрашенного мазка, приготовленного из такой культуры, в нем обнаруживаются морфологически и тинкториально однородные клетки. В случае выраженного полиморфизма, присущего некоторым видам бактерий, в мазках из чистой культуры наряду с типичными встречаются и другие формы клеток.
Пробирки с набором сред Гисса поставьте в штатив в один ряд. На каждой пробирке подпишите название сахара, содержащегося в среде. На первой пробирке каждого ряда кроме названия сахара укажите исследуемую культуру. Произведите посев.
Посев произведите уколом, погружая петлю с исследуемой культурой вглубь питательной среды до дна пробирки. Там, где под действием протеолитических ферментов микробов произошло расщепление белков желатина, отмечается разжижение питательной среды.
Для выявления индолообразования петлю исследуемой культуры засейте в пробирку с мясо-пептонным бульоном. После посева в пробирку внесите полоску индикаторной бумаги, пропитанную раствором щавелевой кислоты, так, чтобы индикаторная бумага не касалась питательной среды. Посевы инкубируют в термостате 24-48 ч. при температуре 37ºС. Образование индола определяют по окрашиванию бумаги в бледно-розовый цвет.
Петлю исследуемой культуры засейте в пробирку с мясо-пептонным бульоном. Затем в пробирку внесите пропитанную ацетатом свинца полоску индикаторной бумаги. В положительных случаях образующийся в культуре сероводород вступает в соединение с бесцветным ацетатом свинца и превращается в сульфат свинца, который придает индикаторной бумаге черно-бурое окрашивание. Тема: Дыхание бактерий. Брожение. Методы выделения чистых культур анаэробов. Цель: Освоить методы выделения чистых культур анаэробных микроорганизмов. Вопросы для самоподготовки
а) физический; б) химический; в) биологический. Литература
Как отмечалось в разделе о питании бактерий, поступающие в микробную клетку питательные вещества трансформируются в составные части цитоплазмы, ядрные субстанции, оболочки клетки и т. д. Для этих сложных синтетических процессов необходима затрата определённого количества энергии, которую микробная клетка должна получать для поддержания своей жизнедеятельности также непрерывно, как и питательные вещества. Затрата энергии необходима не только для синтетических процессов, но и для всех других многочисленных проявлений жизнедеятельности бактерий. Сюда относятся рост и размножение микробов, их движение, образование спор и капсул, выработка токсинов. Микробные клетки всю необходимую энергию получают за счет экзотермических химических реакций, осуществляемых путём окисления различных химических соединений, обладающих большими запасами потенциальной энергии. Совокупность биохимических процессов, в результате которых освобождается энергия, необходимая для жизнедеятельности клеток, называется дыханием или биологическим окислением. Бактериальные клетки, имея относительно простую структуру и чрезвычайно малые размеры, отличаются большим разнообразием типов дыхания. В дыхании микроорганизмов определяющую роль играют окислительные ферменты, причем различные типы дыхания микробов связаны с определённым набором их ферментов. В химизме дыхательных процессов всех типов дыхания микроорганизмов имеется много общего, однако, по специфичности определенных стадий реакции выделяет aэрoбный, анаэробный и смешанный тип дыхания. Во всех случаях первым этапом дыхания является отнятие водорода от субстрата с помощью специфических ферментов - дегидрогеназ. А так как в структуре атома водорода на орбите имеется один электрон, то процесс отнятия электрона водорода от субстрата расценивается как окислительный субстрат – H2 + дeгидpoгинaзa oкиcленый субстрат + дегидрогеназа – Н2. Эта реакция является примером реакции окисления - восстановления. Сущность окисления состоит в потере электронов окисляющимся веществом, тогда как сущность восстановления состоит в присоединении электронов восстанавливающимся веществом. В приведенной выше реакции фермент дегидрогеназа восстанавливается вследствие присоединения электронов водорода субстрата. Последовательность биохимических реакций в протекании обменных процессов в бактериальной клетке возможна благодаря изменениям окислительно-восстановительного потенциала (гН2), под которым понимают способность вещества отдавать или получать электроны. Окислительно-восстановительный потенциал зависит от температуры, pH среды и других причин. Он может изменяться в зависимости от аэробиоза или анаэробиоза. Строгие анаэробы растут при гН2 - 0-12, факультативные анаэробы при 0-20, аэробы при гН2 - 14-20. Бактерии в большинстве случаев получают необходимую энергию для своей жизнедеятельности путём окисления углеводов и некоторых органических кислот. У аэробов процесс расщепления углеводов происходит путём окислительных реакций. При этом вещество разлагается до самых простых соединений – Н2О, CO2 и др. с выделением большого количества тепловой энергии. Процесс аэробного расщепления одной грамм-молекулы глюкозы можно представить следующим образом: С6H12О6 + 6O2 = 6CO2 + 6Н2О + 674 калории. В анаэробных условиях расщепление вещества происходит за счёт сложных внутримолекулярных химических превращений в бактериальной клетке, которое обеспечивается особой системой ферментов. Расщепление углеводов в анаэробных условиях называется процессом брожения. Пастер показал, что брожение, в зависимости от видов микробов, которые его обусловливают, может быть спиртовым, маслянокислым, уксуснокислым. Это значит, что в процессе брожения образуется не только углекислый газ и вода, но и ряд более сложных продуктов: винный спирт, масляная или уксусная кислоты. Количество освобождающейся энергии в процессе брожения намного меньше, чем при аэробном дыхании. Та же грамм-молекула глюкозы под действием дрожжевых клеток в анаэробных условиях расщепляется с освобождением всего лишь 27 калорий С6Н12О6 2С2Н5ОН + 2СО2 + 27 калорий. Маслянокислые бактерии расщепляют грамм-молекулу глюкозы с образованием 15 калорий. С6Н12О6 CH3CH2CH2COOH + 2CO2 + 2H2 + 15 калорий. Общность процессов аэробного дыхания и брожения выражается в том, что в обоих случаях расщепление углеводов до определённого момента идет по одному пути и сопровождается появлением одних и тех же промежуточных продуктов и лишь на конечных этапах в случаях анаэробных процессов распад углевода идёт до спирта, молочной кислоты или других продуктов неполного окисления, а при аэробном - до полного окисления т. е. до углекислоты и воды. В энергетическом отношении аэробное дыхание целесообразнее анаэробного. Так, если при аэробном процессе окисление глюкозы до С02 и Н2О освобождается 674 калорий, то при спиртовом брожении - 27 калорий, а при маслянокислом всего лишь 15 калорий. Это объясняется тем, что конечные продукты, получаемые в результате анаэробного окисления, представляют собой сложные органические соединения, имеющие большой запас энергии. Это приводит к тому, что значительная часть освобождающейся при анаэробном дыхании улетучивается в виде тепла и только 30 % выделившейся энергии используется в процессах жизнедеятельности бактерий. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||