Общая микробиология. Виды микроскопии назначение и принципы применения

• Название: Виды микроскопии назначение и принципы применения
• Анкор: Общая микробиология.doc
• Дата: 12.12.2017
• Размер: 1.57 Mb.
• Имя файла: Общая микробиология.doc
• Тип: Литература; #11046
• страница: 11 из 40

Окрашивание амилоидной оболочки

Применяют для большин­ства сумчатых и несовершенных грибов.

Техника. Краси­тель – раствор Люголя. Несколько капель раствора добавляют к готовому препарату на предметное стекло. Время окрашивания от нескольких секунд до 1 часа.

Микроскопическая картина. Амилоидные оболочки окраши­ваются в синий цвет.

Окрашивание клеточной оболочки

Метод Пешкова

Применяют для дрожжей и низших грибов.

Техника. Препарат фикси­руют в жидкости Карнуа и опускают на 2-5 мин в 10-ный рас­твор танина, тщательно промывают и красят фуксином Пфейффера в течение 30-60 секунд, не промывая микроскопируют.

Микроскопическая картина. Оболочки ок­рашиваются в синеватые цвета.

Окрашивание генциановым фиолетовым и конго красным

Применяют для всех видов грибов.

Техника. Препарат фиксируют любым спо­собом, помещают в 0,5-ный водный раствор генцианового фио­летового на 1,5-2 мин, промывают, помещают в 0,5-ный водный раствор конго красного на 2-3 мин, промывают, подсушивают.

Микроскопическая картина. Оболочки окрашиваются в темно-синий или черный цвет

Окрашивание хитиновых веществ

Метод Висселинга

Техника. Препарат кипятят в концентрированной щелочи в течение часа, промывают, нейтрализуют серной кисло­той до получения нейтральной реакции. Затем добавляют две капли раствора йода в йодистом калии и несколько капель раз­веденной серной кислоты.

Микроскопическая картина. Хитин окрашивается в ярко-фиолето­вый цвет.

Определение хитина и хитозана в мицелии

Техника. Отфильтрованный мицелий помещают в аппарат Сосклета для удаления жира эфиром и, если надо, пигмента. Пигмент удаляют спирто-бензолом (1:4) затем отмывают до полного исчезновения спирто-бензола, заливают 4-5-ным едким натром и кипятят в водяной бане 3-4 ч, после чего проверяют на белок биуретовой реакцией.

Для этого к 5-6 мл раствора добавляют такое же количество 10-ного раствора щелочи, хорошо взбалтывают, после чего добавляют 2-3 капли 3-ного раствора сернокислой меди и слабо нагревают; белок окрашивается в фиолетовый цвет.

Если реакция отрицательная, то мицелий отмывают от щелочи до нейтральной реакции и обра­батывают 50-ным едким натром при 140С в течение 1-2 ч. Проверяют наличие хитозана качественной реакцией со слабым раствором йода; хитозан окрашивается в фиолетовый цвет.

Да­лее препарат заливают 1-2-ной уксусной кислотой, в которой хитозан растворяется. После окончательного растворения хито­зана, о чем судят по исчезновению фиолетовой окраски, оста­ется хитин, который окрашивается слабым раствором йода в ин­тенсивный коричневый цвет. Для количественного определения полученный материал заливают абсолютным спиртом на 2-3 ч, высушивают в вакууме при 40С и гидролизуют концентрированной соляной кислотой. Затем определяют количество редуцирующих сахаров (методом Хагедорна-Йенсена).
Окрашивание ядерного аппарата

Метод Фельгена

Техника. Препарат фиксируют жид­костью Карнуа в течение 10-30 мин, промывают 80-ным спиртом и проводят через нисходящие концентрации спиртов. Реакция проявляется только в гидролизованном материале. Последова­тельность гидролиза: препарат помещают на 2-3 мин в 1 N pаствор соляной кислоты при комнатной температуре, затем на 5-6 мин в 1 N pаствор соляной кислоты, нагретой до 60С, и снова в первый раствор на 1-2 мин, затем помещают в реактив Шиффа на 2-3 ч. Реактив Шиффа готовят следующим образом: 0,5 г основного фуксина растворяют в 90 мл кипящей дистиллирован­ной воды, охлаждают до 50С, фильтруют и прибавляют 3 мл кон­центрированной соляной кислоты. Отдельно в 10 мл холодной воды растворяют 2 г безводного или 4 г кристаллического сульфата натрия. Полученный раствор сульфата приливают к раствору фуксина, охлажденному до 25С.

Второй способ приготовления раствора Шиффа: 1 г основного фуксина для фуксинсернистой кислоты растворяют в 200 мл кипя­щей дистиллированной воды, охлаждают до 50С, фильтруют и до­бавляют 20 мл 1 N cоляной кислоты, охлаждают до 25С и до­бавляют 1 г метабисульфита натрия или калия. Реактив хранят на холоду в широкой склянке с притертой пробкой. Реактив считается пригодным, пока он сохраняет запах сернистого газа и цвет бледного чая (розовая окраска является цветом непри­годности).

Препарат промывают по 15-20 мин в трех порциях сернистых вод и затем в дистиллированной воде. Способ приготовления сернистых вод: 1) к 200 мл дистиллированной воды добавляют 4 мл концентрированной соляной кислоты; отдельно в 25 мл дис­тиллированной воды растворяют 4 г безводного или 8 г кри­сталлического сульфата натрия, приливают этот раствор к подкисленной воде, взбалтывают и дают отстояться или 2) 0,5 г метабисульфита натрия или кали, 5 мл 1н. соляной кислоты по­мещают в колбу и доводят объем раствора до 100 мл дистилли­рованной водой. Для получения более контрастных препаратов их докрашивают 0,1-0,25-ным раствором, лучше слабо подкисленным, светло-зеленого или водного голубого (вассерблау). Препарат промывают водой, высушивают, проводят через ряд спиртов восходящей концентрации до абсолютного, ксилол и по­мещают в бальзам.

Микроскопическая картина. Ядерные элементы окрашиваются в красно-фиолетовый цвет, протоплазма при докрашивании приобретает зеленый оттенок. Лучше всего окрашиваются конидии несовер­шенных грибов.