Общая микробиология. Виды микроскопии назначение и принципы применения
 Скачать 1.57 Mb.
|
Окраска по РомановскомуТехника. Высушенные на воздухе препараты без фиксации опускают на 1-2 мин в раствор неразведенного красителя Романовского. Затем их промывают дистиллированной водой, высушивают на воздухе и микроскопируют с иммерсионной системой. Микроскопическая картина. Элементарные тельца, окрашиваемые этим способом, имеют синий цвет на голубом фоне препарата. Окраска по МуромцевуТехника. Влажные мазки или отпечатки фиксируют 1-2 ч в этиловом или метиловом спирте комнатной температуры или 15-20 мин в спирте, подогретом до 50-70°С. После промывания дистиллированной водой красят 5-10 мин синим Менсона, разведенным в 40 раз. Синий Менсона: в 10 мл кипящей воды растворяют 5-8 г химически чистой буры, добавляют 2 г метиленового синего. Окрашенный препарат, не промывая, дифференцируют 5-10 мин в водном растворе танина (5-10%). После приобретения препаратом голубоватого оттенка его промывают дистиллированной водой и подсушивают фильтровальной бумагой. Препарат проводят через абсолютный спирт или 50% смесь абсолютного спирта с ацетоном, после чего он готов для микроскопирования. Микроскопическая картина. В окрашенном препарате фон и цитоплазма клеток бледно-голубые, тельца Бабеша-Негри резко очерчены, фиолетовые с розовым оттенком, ядра синие, ядрышки темно-синие, эритроциты оранжево-красные. Окраска по МорозовуТехника. Приготовление реактивов и порядок окраски см. выше. Микроскопическая картина. Элементарные тельца имеют вид темно-коричневых, почти черных зерен на светло-коричневом фоне. Окраска по СеллеруТехника. Влажный мазок или отпечаток без фиксации 10 секунд окрашивают смесью из насыщенных растворов в метиловом спирте основного фуксина (3-5 мл) и метиленового синего (15 мл), а также чистого метилового спирта (25 мл). Промывают проточной водой и сушат на воздухе; препарат готов для микроскопии. Микроскопическая картина. Тельца Бабеша-Негри пурпурно-красные, цитоплазма, ядра и ядрышки синие, эритроциты кирпично-красные (рис.28). Окраска по ПигаревскомуТехника. Препарат, высушенный на воздухе в течение 10 мин и нефиксированный, окрашивают 1 мин смесью, состоящей из насыщенных растворов метилового зеленого (3,2 мл), пиронина (6 мл), оранжевого (1 мл) и дистиллированной воды (75 мл). После промывания проточной водой дальнейшая окраска, как по Селлеру (см. выше). Микроскопическая картина. Цитоплазма клеток сиреневого цвета, включения ярко-красные. Задания к лабораторному занятию
РАЗДЕЛ: “ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ” Тема: Питание бактерий. Культивирование бактерий. Искусственные питательные среды. Цель: Охарактеризовать принципы культивирования бактерий. Вопросы для самоподготовки
Литература
Питательные среды служат для выделения из исследуемого материала чистых культур микробов и изучения их свойств. Питательные среды являются основой бактериологических работ, нередко определяя своим качеством результаты исследования В состав сред, применяемых для выращивания бактерий, входят необходимые для построения их структуры органогены: азот, углерод, кислород, неорганические соединения, содержащие фосфор, серу, натрий, магний, железо, микроэлементы: кобальт, йод, марганец, бор, медь и др. Все неорганические элементы должны находится в питательной среде в удобоусвояемом для данного микроорганизма соединениях. Потребность в кислороде и водороде бактерии удовлетворяют за счёт поступающей в клетки воды. По характеру усвоения азота патогенные микроорганизмы делятся следующим образом: одни из них извлекают его из простых аммонийных соединений, другие нуждаются в аминокислотах, третьи расщепляют высокомолекулярные вещества –пептоны, представляющие собой продукты ферментации белков. Облигатные паразиты размножаются только в присутствии нативного т.е. неизменяемого белка. Потребность бактерий в неорганических элементах удовлетворяются прибавлением к питательной среде NaCl, KH2PO2, K2HPO4 и т.д. Микроэлементы, выполняющие роль катализаторов химических процессов, поступают в питательную среду с пептоном, неорганическими солями и водой. Кроме того бактерии нуждаются в ростовых факторах, которые по своей роли соответствуют витаминам для животных. Источником факторов роста, являются прибавляемые к питательной среде продукты растительного и животного происхождения, содержащие в своём составе никотиновую, парабензойную кислоты, витамины А, В, С и др. Ряд микробов в процессе жизнедеятельности вырабатывают кислоты, сдвигающие РН в кислую сторону, вследствие чего может прекратится их рост. Поэтому к питательным средам добавляют, так называемые, буфер-вещества, сохраняющие установленную реакцию среды (например, фосфорнокислые соли). Правильный подбор состава среды обеспечивает возможность выделения микроорганизмов из мест их обитания, получения чистых культур, изучения их морфологии и биохимических особенностей, способствует быстрой и правильной диагностике инфекционных заболеваний, дает возможность получить биомассу полезных для народного хозяйства микроорганизмов. Питательные среды не могут быть универсальными для всех видов микробов, так как микроорганизмы обладают индивидуальными особенностями питания и проявляют свои характерные физиологические свойства в определённых условиях обмена. Поэтому на практике пользуются разнообразными питательными средами, применительно к тому или иному виду микробов. Требования, предъявляемые к питательным средам Готовые питательные среды должны:
По составу питательные среды подразделяются на естественные, искусственные и синтетические. Естественные среды состоят из натуральных продуктов животного или растительного происхождения. Основой таких сред являются молоко, яйца, овощи, животные ткани, желчь, сыворотка крови. На естественных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как в таких средах имеются все компоненты для их роста и размножения. Синтетические среды – это такие среды, в состав которых входят только определенные, химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Синтетические среды могут иметь большой набор компонентов, но могут быть и простыми по составу. Эти среды удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов. Зная точный состав и количество входящих в среду компонентов, можно изучить их потребление и превращения в соответствующие продукты обмена. По консистенции среды бывают жидкие, полужидкие, плотные, сыпучие и сухие. Жидкие среды применяют для изучения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы или продуктов обмена микроорганизмов. Примером наиболее часто применяемой жидкой питательной среды является мясо-пептонный бульон (МПБ). Для его приготовления сначала готовят мясной отвар. С этой целью свежее мясо (говядину, телятину) освобождают от костей и сухожилий, пропускают через мясорубку. 500 г такого фарша заливают 1 л водопроводной воды и оставляют на 24 часа для экстрагирования необходимых для питания микроорганизмов веществ. Затем мясо отжимают через марлю и полученный настой кипятят в течение 30 минут для свёртывания белка, который отделяют фильтрованием. Отфильтрованный настой стерилизуют. Стерильная мясная вода является основой для приготовления мясо-пептонного бульона. Для этого к 1 л мясной воды добавляют 10 г пептона и 5 г NaCl. Пептоны добавляют взамен свернувшегося белка. Они являются продуктами неполного разрушения белка, получаемыми кислотным или ферментативным гидролизом мяса или молочного казеина. Преимуществом этих источников аминокислот является то, что они легко усваиваются и при стерилизации не свёртываются. Поэтому стерильный бульон остаётся прозрачным. Рост микроорганизмов в таких средах легко отмечается визуально по появлению мутности. МПБ – богатая питательная среда, но в ней мало углеводов. Плотные среды необходимы для выделения и изучения свойств чистых культур микроорганизмов, так как на них можно получить изолированный рост отдельных клеток. Плотные питательные среды (мясо-пептонный агар (МПА)) готовят из жидких посредством добавления к ним агар-агара. Агар-агар (по малайски – желе) получают из водорослей. Это сложный полисахарид, который образует гель с точкой плавления 96 – 100 ºС и температурой застывания 40 ºС. Несколько циклов плавления и затвердевания не влияют на способность агара образовывать гель, поэтому агаровые среды можно несколько раз стерилизовать. Плотные питательные среды получают, добавляя к жидким 1-2% агар-агара. Среду с внесённым в неё агаром нагревают на водяной бане до расплавления последнего. Полученный горячий раствор фильтруют через гигроскопическую вату и разливают по чашкам Петри и пробиркам. Сухие питательные среды изготовляются в виде сухих порошков, которые хорошо растворяются в воде при комнатной температуре. Преимущество таких сред в их стандартности, стабильности, простоте приготовления и удобстве при транспортировке. Сухие питательные среды представляют собой гигроскопические порошки, хранящиеся в специальных флаконах. В лаборатории из порошков готовят соответствующие питательные среды по прописи указанной на этикетке. Чаще всего применяют сухой питательный агар, среду Эндо. По назначению среды подразделяются на обычные (простые), специальные, элективные, дифференциально-диагностические. Обычные (простые) среды используют для культивирования большинства микроорганизмов. Это мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА). Специальные среды – это среды, предназначенные для выявления тех или иных микроорганизмов или получения культуры микроорганизмов, обладающих особыми свойствами. Среди специальных сред различают: 1. элективные (избирательные) 2. дифференциально-диагностические (индикаторные) среды. Элективные среды (от латинского слова electus – избираю) подобраны таким образом, чтобы обеспечить оптимальные условия для выращивания определённых микроорганизмов. В них могут быть добавлены вещества, избирательно подавляющие развитие сопутствующей микрофлоры. При посеве материала, содержащего смесь различных микроорганизмов, раньше всего проявляется рост того вида, для которого данная среда будет избирательно пригодна. Сопутствующие микроорганизмы или совсем не растут на таких средах, или развитие их задерживается. Такие среды применяют для выделения микробов определённых видов из объектов, содержащих постороннюю микрофлору. Например, холерный вибрион может развиваться в присутствии относительно высокой концентрации щелочи(1%), губительно действующей на сопутствующую. Дифтерийная палочка опережает по быстроте роста на свёрнутой кровяной сыворотке Лёффлера сопутствующую микрофлору зева. Дифференциально-диагностическине среды применяются для изучения биохимических свойств и отличия (дифференцировки) одного вида микроорганизмов от другого по характеру их ферментативной активности. Их состав подбирается с таким расчетом, чтобы он позволил чётко выявить наиболее характерные свойства данного вида. Это достигается введением в среды специальных красителей-индикаторов (нейтральный красный, феноловый красный, метиленовый синий). Изменяя окраску при различных значениях РН, индикатор указывает на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления вводимого в среду субстрата. Примером таких сред является среда Эндо, применяемая для выделения и определения бактерий кишечной группы. В состав этой среды входит МПА, лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. Исходная питательная среда окрашена в светло-розовый цвет. При сбраживании лактозы образуется ацетальдегид, который Взаимодействует с сульфитом и окрашивает колонии кишечной палочки в красный с металлическим блеском цвет. Таким образом, на среде Эндо легко отличить кишечную палочку от брюшно-тифозных и дизентерийных микроорганизмов, которые дают бесцветные колонии, так как не сбраживают лактозу. Однако индикатор не является обязательной составной частью сред, предназначенных для выявления ферментов. Так, наличие желатиназы и других протеолитических ферментов в культуре определяют по разжижению желатина, свёрнутого яичного или сывороточного белка. По своему назначению дифференциально-диагностические питательные среды подразделяются следующим образом:
Засеянные среды выдерживают в условиях, обеспечивающих жизнедеятельность микроорганизмов. К таким условиям относится температурный режим, влажность, аэрация, свет и другие специфические факторы. Температура. Оптимальную для микроорганизмов температуру обеспечивают в специальных шкафах-термостатах. Термостат-прибор, в котором с помощью терморегуляторов поддерживается постоянная температура. За температурой в термостате следят по показаниям термометра. Используют термостат для выращивания микроорганизмов на питательных средах при оптимальной температуре. Для большинства патогенных микроорганизмов оптимальной температурой роста является температура +37 °С. Влажность. Культивирование микроорганизмов возможно только во влажных условиях. Для бактерий необходимо капельно-жидкая вода, так как питательные вещества проникают в клетку только в растворенном состоянии. Минимальное содержание свободной воды, при котором возможно развитие, для большинства бактерий равно 20%. При культивировании в жидких средах проблема поддерживания влажности отпадает. Плотные агаризованные среды всегда содержат некоторое количество капельно-жидкой воды. Она бывает заметна в виде конденсата на стенках пробирок. Однако при длительном хранении культур на плотных средах при комнатной температуре, и даже в холодильнике, среды подсыхают,что может привести к гибели микроорганизмов. Поэтому необходимо производить регулярные своевременные пересевы культур, не допуская подсыхания сред. Свет. Подавляющему большинству микроорганизмов свет не нужен. Прямые солнечные лучи отрицательно влияют на развитие многих микроорганизмов. В лабораторных условиях микроорганизмы культивируют в неосвещенных термостатах. Микроорганизмы, использующие в процессе обмена веществ энергию света, выращиваются при освещении. Для освещения обычно применяют лампы накаливания мощностью 75-100 Вт. ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ. Чистая культура микроорганизма - это популяция клеток одного вида, выросшая на стерильной питательной среде. Чистую культуру выделяют путем получения потомства одной родительской клетки. Культура может расти в виде отдельных колоний на плотной питательной среде. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР АЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ. Все методы выделения чистых культур из микробных смесей можно разделить на 2 группы:
Методы, основанные на принципах механического разделения микроорганизмов Рассев шпателем по Дригальскому Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На первую чашку петлей или пипеткой наносят каплю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности агара. Затем шпатель переносят во вторую чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в третью чашку Петри и аналогичным образом производят посев. На первой чашке вырастает максимальное количество колоний (сплошной pocт) на третьей - минимальное в виде отдельно расположенных колоний. Метод истощающего штриха В целях экономии сред и посуды можно пользоваться одной чашкой, разделив её на 4 сектора и последовательно засеяв штрихом. Для этого материал берут петлёй и проводят ею на расстоянии 5 мм друг от друга ряд параллельных штрихов сначала по поверхности первого сектора, а затем последовательно оставшимися на петле клетками засевают все другие секторы. При каждом последующем штрихе происходит уменьшение количества засеваемых клеток. После рассева чашки переворачивают вверх дном, чтобы конденсационная вода, образовавшаяся на крышке чашки Петри, не мешала получить изолированные колонии. Чашки выдерживают в термостате 1-7 суток, так как скорость роста различных микроорганизмов неодинакова. Таким образом, в первых секторах получается сплошной рост, а вдоль последующих штрихов вырастают обособленные колонии, представляющие собой потомство одной клетки. Метод прогревания Позволяет отделить спорообразующие бациллы от неспоровых форм. Прогревают исследуемый материал на водяной бане при 80°С 10-15 минут. При этом погибают вегетативные формы, а споры сохраняются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают, образуя колонии только спорообразующих бактерий. Метод обогащения Исследуемый материал засевают на элективные питательные среды, способствующие росту определенного вида микроорганизмов. Метод заражения лабораторных животных Этот метод используется для выделения чистой культуры из патологического материала, загрязненного посторонней микрофлорой, или в том случае, когда в исследуемом материале очень мало патогенных микроорганизмов. Для заражения подбирают наиболее восприимчивые к предполагаемому возбудителю инфекции виды животных. Например, для выделения пневмококка из мокроты заражают белую мышь. Это животное весьма чувствительно к данному микробу и резистентно к другим микробам, находящихся в мокроте. В связи с этим пневмококк быстро размножается в организме мыши, а другие микробы погибают. Через 18-20 часов после заражения мышь забивают и кровь, взятую из сердца, засевают на питательную среду. Так как в крови содержится один пневмококк, то на питательной среде вырастает чистая культура. Методы, основанные на биологических свойствах микроорганизмов Биологические методы выделения чистых культур основаны на учете того или иного свойства выделяемого микроба, отличающего его от других, находящихся с ним в смеси. Метод Шукевича Применяется для выделения подвижных микроорганизмов. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара, находящегося в пробирке. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются по агару, как бы "вползают" на его поверхность. Из верхней части роста производят высев в конденсационную воду свежей питательной среды. Производя таким образом несколько пересевов, в конце концов получают чистую культуру подвижной бактерии. Метод ингибирования Основан на различном действии некоторых химических веществ и антибиотиков на микроорганизмы. Определённые вещества угнетают рост одних микроорганизмов и не оказывают влияния на другие. Например, небольшие концентрации пенициллина задерживают рост грамположительных микроорганизмов и не влияют на грамотрицательные. Первый этап выделения чистой культуры
Задания к лабораторному занятию
Посевы производят так, чтобы в питательную среду не попали из воздуха посторонние микробы. Все манипуляции, связанные с посевом микробных культур производят над пламенем горелки. Бактериальную петлю прокаливают над пламенем непосредственно перед взятием материала, затем петлю остужают. Для этого при посеве микробной культуры из пробирки петлю погружают в конденсационную жидкость, а при посеве с чашек Петри прикасаются к поверхности питательной среды, свободной от микробного роста. Достаточно остуженная петля не вызывает шипения конденсационной жидкости и не растапливает агар при соприкосновении со средой. При посеве в жидкую питательную среду петлю с находящимся на ней пересеваемым материалом вводят в пробирку до дна. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стекле пробирки, а затем смывают жидкой средой.
При посеве смеси микробов на плотную питательную среду вначале отмечают сектора карандашом по дну чашки Петри. Чашку Петри держат в левой руке, крышку приоткрывают настолько, чтобы в образовавшуюся щель свободно проходила петля. Небольшое количество исследуемого материала втирают бактериальной петлёй в поверхность питательной среды у края чашки. Затем петлю прожигают, чтобы уничтожить избыток находящегося на ней материала. Линию посева начинают с того места, в котором находится материал. Бактериальную петлю кладут плашмя на питательную среду, чтобы не поцарапать её поверхности и проводят штрихи по секторам. Нужно стараться, чтобы штрихи, нанесенные петлёй, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева, и дает возможность получить изолированные колонии микробов. В результате бактерии равномерно распределяются на агаре, размножаются и дают скопление микробов в виде видимых невооруженным глазом отдельных колоний.
Исследуемый материал прогреть в течение 10 минут при 80 °С на водяной бане, а затем произвести высев на чашку Петри. При этом погибают вегетативные формы, а споры сохраняются и при посеве на МПА прорастают в виде колоний. Тема: Рост и размножение бактерий. Колонии микроорганизмов. Пигментообразоваиие. Цель: Оценить основные признаки бактериальных колоний. |