Общая микробиология. Виды микроскопии назначение и принципы применения
 Скачать 1.57 Mb.
|
Определение чувствительности бактерий к антибактериальным химиопрепаратам методом диффузии в агарПодбирают одинакового размера чашки Петри, устанавливают их на горизонтальную поверхность (отрегулированную по ватерпасу), наливают 10 мл незараженного “голодного” агара. После застывания этого слоя на него помещают стерильные цилиндры из стекла или нержавеющей стали (высота 10 мм, внутренний диаметр 6 мм) и заливают их “зараженным” агаром в количестве 15 мл. Для этого растопленный и охлажденный агар добавляют к агаровому смыву суточной культуры или к смыву, полученному из патологического материала. Густоту взвеси определяют по стандарту мутности № 5 с последующим разведением до нужного количества микробных клеток в 1 мл.По застывании второго слоя агара цилиндры вынимают и в образовавшиеся лунки вносят испытуемые химиопрепараты антибактериального действия. В каждую лунку помещают 0,3 + (-) 0,05 мл исследуемого препарата. Мазевые формы вносят в лунку до полного ее заполнения. В одной чашке Петри можно испытать активность шести образцов различных препаратов. Посевы термостатируют при t 37 º C в течение 24-48 часов, затем учитывают результаты. Измеряют зоны задержки роста тест-микроба, отчетливо видных вокруг лунок. Высокочувствительными к данному антибиотику считают микроорганизмы, дающие при его действии зоны задержки роста, превышающие 25 мм, чувствительными - 15-25 мм, малочувствительными – 11-15 мм. Оценка результатов аналогична приведенной в описании метода “бумажных дисков”. Метод последовательных разведений антибактериальных химиопрепаратов в питательной среде является более надежным и точным количественным методомУстановление степени чувствительности к ряду антибактериальных препаратов микроба, вызывающего инфекционный процесс, влияет на выбор химиопрепарата (отказ от препаратов, характеризующихся относительно высокой токсичностью при умеренной чувствительности к ним возбудителя), его дозировку (концентрация антибиотика в крови в 2-3 раза должна превышать его МПК в отношении возбудителя) и режим введения.Существуют две модификации метода определения чувствительности микробов к антибактериальным химиопрепаратам на жидкой и на плотных питательных средах. Метод дает возможность определить минимальную подавляющую рост концентрацию препарата (МПК) для выделенного штамма возбудителя. Он заключается в приготовлении ряда последовательных разведений антибактериального химиопрепарата в питательной среде с внесением во все разведения исследуемой культуры. По подавлению роста микроба определённой концентрацией препарата в питательной среде судят о степени чувствительности микроорганизма. Ряд разведений химиопрепарата в жидкой питательной среде служит для определения чувствительности данного штамма. На чашке Петри с плотной питательной средой можно определить чувствительность большого числа штаммов (20 и более при посеве штрихом или с помощью штампа-репликатора). Метод серийных разведений в плотной питательной среде даёт возможность определить чувствительность к антибактериальным химиопрепаратам отдельных вариантов штамма. При использовании жидкой среды выявляется чувствительность штамма в целом. При определении чувствительности методом серийных разведений необходимо выделение возбудителя в чистой культуре. Различают бактерицидное (убивающее микробы) и бактериостатическое (задерживающее рост микробов) действие препаратов. В отношении противогрибковых препаратов говорят о фунгицидной (фунгистатической) активности. Метод двукратных серийных разведений в жидкой питательной средеМясо-пептонный бульон (или бульон Сабуро, или другой, на котором растет изучаемый микроб) разливают по 1 мл в пробирки, расставленные в штативы по 10 в ряду. В первую пробирку вносят 1 мл раствора антибактериального химиопрепарата в нужной концентрации (для антибиотиков удобной концентрацией для основного раствора является 200 мкг/мл или ед/мл). Основные растворы антибиотиков стабильны при хранении в холодильнике в течение 1 недели. После тщательного перемешивания переносят мерной пипеткой 1 мл из этой пробирки во вторую, перемешивают и переносят тоже количество смеси из второй в третью и т. д. до девятой пробирки, из которой 1 мл выливают, чтобы во всех пробирках объем жидкости был одинаков. Десятая пробирка, не содержащая препарат, служит контролем на рост культуры микроорганизма. После этого во все пробирки, содержащие серийно разведенный препарат, и в контрольную пробирку вносят одинаковое количество во взвеси тест-культуры. Для этого 18-ти часовую культуру (для микроорганизмов, рост которых замедлен, используют 48-ми часовую культуру) испытуемого микроба на косом агаре смывают физиологическим раствором, доводят до густоты 5 ЕД по стандарту мутности с последующим разведением до нужного количества микробных клеток в 1 мл и вносят в пробирки с серийно разведенным препаратом. Результаты учитывают, определяя наличие или отсутствие роста микроба в среде, содержащей различные разведения антибактериального химиопрепарата. Последняя пробирка с задержкой роста (прозрачный бульон) соответствует МПК препарата в отношении испытуемого штамма и указывает на степень его чувствительности. Если среда помутнела во всех пробирках, то испытуемый микроб устойчив к максимально взятой в опыт концентрации антибактериального химиопрепарата. Отсутствие роста во всех пробирках, кроме контрольной свидетельствует о том, что МПК препарата в отношении микроба ниже используемой концентрации. Для определения бактерицидной концентрации из 2-3 последних пробирок с отсутствием видимого роста производят посев на агар или бульон. Через 24-48 часов инкубации в термостате отмечают ту наименьшую концентрацию антибактериального химиопрепарата в пробирке, посев из которой не дал роста, и принимают за минимальную бактерицидную концентрацию (МБК). Метод двукратных серийных разведений в плотной питательной средеПринцип опыта тот же, что и при определении чувствительности микроорганизмов к антибактериальным химиопрепаратам в жидкой питательной среде. Перед постановкой опыта агар расплавляют в водяной бане и охлаждают до 50-60 º С. Готовят двукратные разведения антибактериального химиопрепарата, после чего вносят по 1 мл каждого разведения в пробирку, содержащую 4 мл агарированной расплавленной и охлажденной среды. Затем пробирки скашивают для застывания агара, а на поверхность плотной среды петлёй засевают взвесь тест-культуры. Для постановки опыта в чашках Петри берут 1 объем, содержащий определённое разведение препарата и 9 объемов расплавленного и остуженного агара, тщательно перемешивают в пробирках и выливают в чашку Петри. В контрольную пробирку с агаром вместо раствора антибактериального химиопрепарата вносят 1 объем стерильной дистиллированной воды. Приготовленные таким образом чашки, каждая из которых содержит определенную концентрацию препарата, делят на секторы, на каждый из которых засевают испытуемый штамм. Посев делают петлёй или пастеровской пипеткой. Для посева часто пользуются также специальным штампом-репликотором, позволяющим нанести на поверхность агара одновременно 25-32 испытуемые культуры. Посевы инкубируют в термостате при t-37ºС в течение 18-24 часов, после чего учитывают результаты. За МПК препарата для данного штамма принимают ту, при которой отсутствуют признаки роста на поверхности агара (или вместо бляшки имеется рост единичных колоний). Определение чувствительности микроорганизмов к сульфаниламидам методом разведений в жидких средах Определение чувствительности микроорганизмов к сульфаниламидам затруднено тем, что большинство питательных сред, применяемых для определения лекарственной устойчивости микроорганизмов для этих препаратов не годятся. Эти среды содержат значительные количества метаболитов, которые являются антагонистами сульфаниламидов (РАВА фолиевая кислота и т.п.). Поэтому определение чувствительности микробов к сульфаниламидам производят методом разведений на специальных средах. Для определения чувствительности к сульфаниламидам энтеробактерий рекомендуется среда Биргера и Зац, а бактерий кокковой группы – среда Ланди, которые могут применяться как жидкими, так и агаризованными. В связи с существованием перекрестной устойчивости микроорганизмов к большинству сульфаниламидов при определении чувствительности возбудителей к этим препаратам достаточно проверить чувствительность к одному какому-либо сульфаниламиду – например, норсульфазолу. Разведения сульфаниламидного препарата готовят путем разведения основного раствора препарата стерильной дистиллированной водой согласно представленной схеме (таблица 1). Для получения необходимых концентраций препаратов в среде к 100 мл питательной среды, пригодной для исследуемой группы бактерий, добавляют 1 мл соответствующего раствора препарата. Таблица 1
После добавления соответствующего раствора препарата среду стерильно разливают по 1 мл в пробирки, после чего в каждую пробирку и контрольную (содержащую среду без сульфаниламида) вносят одинаковое количество взвеси тест-культуры. После заражения пробирки инкубируют при 37°С в течение 18-24 часов или более в зависимости от появления роста микробов в контроле. Результаты оцениваются так же, как в методе двукратных серийных разведений в жидкой среде. При приеме обычных терапевтических доз сульфаниламидов наиболее вероятный максимальный уровень препаратов в крови составляет 10-50 мкг/мл. В соответствии с этим, а также сообразуясь с устойчивостью большинства диких штаммов бактерий, выделенных до введения сульфаниламидов в клиническую практику, следует считать клинически устойчивыми к сульфаниламидам штаммы, растущие при концентрации препарата 10-50 мкг/мл и выше. Определение чувствительности микроорганизмов к сульфаниламидам методом разведений в плотных средах Проводится по тому же принципу, что и в методе разведений в жидких средах. В качестве питательных сред используются: Мюллер-Хинтон агар, среды Биргера, Зац, Ланди с добавлением 1,5-2% очищенного агара. Ход определения аналогичен описанному ранее методу двукратных серийных разведений в плотной питательной среде. Определение чувствительности микроорганизмов к нитрофурановым препаратам методом разведений в жидких средах Основные растворы нитрофуранов готовятся в соответствии с растворимостью этих препаратов в воде (табл. 2); раствор фурагина, фуразолидона, фурацилина, фурадонина с концентрацией 200 мкг/мл готовят растворением 10 мг чистого порошкообразного препарат (можно и при нагревании до 60-80°С) в 50 мл бульона; фурагина с концентрацией 75 мкг/мл готовят расворением 20 мг чистого препарата в 267 мл бульона; фуразолидона с концентрацией 40 мк/мл готовят растворением 10 мг чистого препарата в 250 мл бульона. Растворы стабильны при хранении в холодильнике в стерильных условиях в течение месяца. При нарушении стерильности пригодны для применения в течение 5-7 дней при хранении в холодильнике. Таблица 2 Максимальная растворимость в воде нитрофурановых препаратов
Разведения нитрофурановых препаратов готовят путем разведения основного раствора препарата бульоном согласно представленной схеме (таблица 3). Таблица 3
Питательная среда (МПБ) с нитрофурановым препаратом стерильно разливается в пробирки по 2 мл в каждую. Ход определения и оценка результатов описаны в предыдущих методах. Концентрация нитрофуранов в крови обычно редко превышает 5 мкг/мл, поэтому при септических инфекциях следует рассматривать как чувствительные те бактерии, которые подавляются при концентрации препарата 5 мкг/мл и менее. Таким образом, при септических инфекциях достаточно определять действие нитрофуранов в концентрациях 10, 20 и 40 мкг/мл. Культуры, рост которых задерживается всеми тремя разведениями рассматриваются как чувствительные; при отсутствии роста только в двух последних разведениях – как слабо чувствительные, а если действие препарата отмечается только при его концентрации в растворе 40 мкг/мл – как устойчивые. Концентрация нитрофуранов в моче может быть значительно выше, чем в крови, достигая иногда 100 мкг/мл и более. Поэтому при инфекциях в мочевыводящих органах следует определять действие нитрофуранов в концентрациях 20, 40, 75, 100 и 150 мкг/мл (в соответствии с растворимостью препарата). Действие даже одного из двух последних разведений указывает на слабую чувствительность микробов. Определение чувствительности микроорганизмов к энтеросептолу методом разведений в жидких средах Готовят основной раствор энтеросептола с концентрацией 200 мкг/мл. Для этого 2 мл чистого энтеросептола помещают стерильную пробирку, добавляют 2 мг 0,1-N раствора едкого натра, несколько раз тщательно взбалтывают и через 1 час добавляют 8 мл стерильной дистиллированной воды, опять взбалтывают и через несколько часов прозрачный раствор готов к употреблению. При хранении в холодильнике стабилен в течение месяца. Для определения чувствительности одного штамма микроорганизмов берут 4 пробирки, содержащие по 2 мл стерильной питательной среды. В первую пробирку добавляют 0,1 мл, во вторую – 0,2 мл, в третью – 0,4 мл основного раствора энтеросептола. Четвертая пробирка контрольная, энтеросептол к ней не добавляют. Производят заражение 18-часовой культурой. Через 18-24 часа, а для медленно растущих микробов – через 48-72 часа оценивают результаты. Если во всех трех опытных пробирках отмечается обильный рост бактерий, культура рассматривается как устойчивая к действию энтеросептола. Если обильный рост отмечается только в первых двух пробирках – как слабо чувствительная, при росте только в первой пробирке – как чувствительная. Отсутствие или резкая задержка роста во всех трех опытных пробирках указывает на высокую чувствительность исследуемого штамма микроорганизмов. | ||||||||||||||||||||||||||||||||