Общая микробиология. Виды микроскопии назначение и принципы применения
 Скачать 1.57 Mb.
|
РАЗДЕЛ "ЭКОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ"Тема: Распространение микроорганизмов в природеЦель: Изучение методов санитарно-бактериологического исследования почвы, воды, воздуха Вопросы для самоподготовки
Литература
В природе микроорганизмы распространены везде, где они находят условия для роста и размножения. При отсутствии таких условий, микроорганизмы могут лишь временно сохранять свою жизнеспособность. Наиболее благоприятные для жизнедеятельности микробов условия имеются в почве, богатой органическими веществами. Наибольшее количество микроорганизмов наблюдается на глубине 5-15 см от её поверхности. В почве обитают грибы, водоросли, бактерии, фаги, простейшие. Микроорганизмы почвы играют большую роль в круговороте веществ в природе. Почва является основным резервуаром микроорганизмов в природе. Из неё микроорганизмы могут попадать в воду, воздух, на листья растений, лекарственного растительного сырья и т. д. В прибрежных и поверхностных водах открытых водоёмов содержится также большое количество микроорганизмов. Водоёмы, располагающиеся возле крупных городов, а также животноводческих ферм, как правило, богаты микроорганизмами в результате их загрязнения канализационными и сточными водами. Воздух не является благоприятной средой для обитания микробов. Поэтому большинство микроорганизмов могут находиться в нём лишь некоторое время. Патогенные микроорганизмы, обитающие в организме больных или носителей попадая в почву и воду с выделениями (моча, кал), в воздух при разговоре, кашле, чихании могут сохраняться там, в течение определённого времени. В этом случае окружающая среда становится фактором передачи патогенных микробов. Санитарно-микробиологические исследования почвы проводят с целью определения ее санитарно-гигиенического состояния, а также для эпидемиологических исследований, выявления путей заражения и сроков выживаемости патогенных микроорганизмов, загрязнения грунтовой воды и открытых водоёмов. Санитарно-микробиологические исследования воды проводят с целью санитарного контроля и по эпидемиологическим показаниям на наличие патогенных кишечных бактерий (сальмонелл, шигелл), энтеровирусов и показателей свежего фекального загрязнения. Санитарно-микробиологические исследования воздуха проводят с целью определения биологического показателя загрязнения его микрофлорой носоглотки человека, а также непосредственного обнаружения патогенных стафилококков, синегнойных палочек, других грамотрицательных условно-патогенных бактерий – возбудителей внутрибольничных инфекций. На предприятиях микробиологической промышленности изучается содержание в воздухе микроорганизмов-продуцентов. Например, на ферментных заводах – грибов рода Aspergillus и споровых бактерий. Точное количественное определение бактерий в почве, воде, воздухе затруднено в связи с тем, что невозможно создать условия для размножения всех встречающихся в исследуемом материале микроорганизмов, которые отличаются между собой по типам дыхания, питания. Поэтому большое значение для санитарно-микробиологической оценки внешней среды имеют санитарно-показательные микроорганизмы, которыми являются представители нормальной микрофлоры организма человека и теплокровных животных. Эти микроорганизмы легко поддаются обнаружению и определению количественными методами и служат показателем загрязнения окружающей среды выделениями человека. Для почвы санитарно-показательными микроорганизмами являются кишечная палочка – E. coli, Streptococcus faecalis, Clostridium perfrigens. Для воды санитарно-показательными микроорганизмами выбраны – E.coli, Streptococcus faecalis; для воздуха – Streptococcus haemolyticus, Streptococcus viridans, Staphylococcus aureus. Методы санитарно-микробиологического анализа почвы включают количественный учет сапрофитных бактерий, по которому судят о микробном числе почвы; определение количества бактерий группы кишечных палочек методами титрации, мембранных фильтров, методом прямого поверхносного посева; определение Cl. perfringens, сальмонелл, шигелл, клостридий столбняка и ботулизма. При учете численности микроорганизмов почвы применяют диспергирование в воде находящихся в почве бактерий. В асептических условиях, пробы почвы измельчают, растирают в ступке и готовят для чистых почв до 3-4 десятикратных разведений в стерильной водопроводной воде. При определении микробного числа почвы (это количество микроорганизмов, содержащиеся в 1г. почвы) должно быть использовано для посева не менее двух различных разведений, в зависимости от предполагаемого загрязнения исследуемой почвы. Перед посевом каждое разведение в пробирках перемешивают стерильной пипеткой, затем из него отбирают 1мл. и переносят на дно стерильной чашки Петри. Каждое разведение вносят не менее чем на 2 чашки, в которые затем вливают 7-10мл. растопленного и остуженного до 45С МПА или сусло-агара. Расплавленный агар перемешивают с имеющейся взвесью почвы с помощью покачивания чашки. Отмечают разведение пробы и инкубируют при температуре 28-30 ºС в течение 24 часов. Для удобства подсчета следует брать те разведения при которых на чашках вырастает от 50 до 150 колоний. В качестве примера можно привести следующую схему заполнения протокола. Таблица1
Микробное число почвы показывает общую численность в основном сапрофитных микроорганизмов, вырастающих на МПА или сусло-агаре. Для определения коли-титра почвы (наименьшее количество исследуемого материала в граммах, в котором обнаруживается жизнеспособная E. coli) используют элективные питательные среды, содержащие желчь и другие компоненты, тормозящие рост большинства микробов, населяющих почву, кроме кишечной палочки. Метод титрации предполагает засев первоначального разведения почвенной суспензии 1:10 во флаконы с 50мл. жидких сред, что соответствует 1г. почвы. Чаще всего используют посев почвы в лактозный бульон с 1,5мл и 2% водного раствора ТТХ (2-3,5трифенилтетразолия хлорида). Кишечная палочка способна восстанавливать ТТХ бесцветное соединение в трифенолформазан, выпадающий в виде осадка придающего среде красно-коричневый цвет. Кишечная палочка устойчива к действию формазана, который тормозит рост большинства микробов. Посевы инкубируют в течение 24 часов при 37ºС. При наличии в среде ТТХ газообразования и изменения цвета среды на кирпично-красный производят посев на среду Эндо или розоловый агар. При наличии на среде Эндо розовых или красных колоний грам-отрицательных палочек с отрицательной оксидазной активностью осуществляют их подсчет. Для подтверждения их ферментативной способности делают посев выросших колоний на полужидкую среду с глюкозой, затем на 24 ч. помещают при температуре 37С. В случае появления в среде кислоты и газа исследование на наличие кишечных палочек считается положительным. Результат анализа выражают коли-титром. Можно использовать другой метод посева соответствующих разведений почвенной суспензии – на среду Кеслера-Свенертона с последующей экспозицией в течение 24-48 ч. при температуре 37 ºС. После чего в случае газообразования и помутнения на среде Кеслера-Свенертона так же производят высев на среду Эндо или розоловый агар. Дальнейший ход исследований полностью совпадает с выше-описанным. Метод мембранных фильтров Этот метод позволяет сократить время анализа на двое суток благодаря исключению этапа накопления микроорганизмов на жидких средах. При анализе почвы в небольших разведениях (1:10; 1:100), чтобы избежать накопления на фильтрах накопления почвенных частиц, мешающих выявлению кишечной палочки при выращивании на фильтре, на мембранный фильтр накладывают предварительный планктонный фильтр. Подсчет колоний осуществляют на тех фильтрах, где из соответствующего разведения выросло не более 30-50 колоний. Затем осуществляют пересчет выращенных на фильтрах колоний на 1г. почвы. Метод прямого поверхностного посева применяют при анализе загрязненных почв. Для этого среду Эндо разливают в чашки Петри, подсушивают в сушильном шкафу. Готовят почвенную суспензию, как указанно ваше, используя разведение до 1:1000000. Посевы выращивают при температуре 37 ºС в течение 24 часов. Затем производят подсчет розовых и красных колоний с металлическим блеском. Для более точного определения соответствующие бактерии должны быть изучены по схеме, которая применяется при исследовании воды. При необходимости перевода коли-индекса в титр кишечной палочки необходимо 1000 разделить на число, выражающее коли-индекс. Определение Clostridium perfringens Готовят почвенные разведения до 1:100000, которые переносят по 1мл. в два ряда пробирок. Один ряд прогревают в течение 15 мин. при 80 ºС или 10 мин. при 90 ºС. Затем во все пробирки вносят по 10 мл. расплавленной и охлажденной до 45 ºС среды Вильсона-Блер и вращением пробирки между ладонями равномерно распределяют почвенную суспензию и быстро опускают в холодную воду для быстрого охлаждения и удаления воздуха из среды. Учет колоний можно начинать через 2 часа экспозиции при 43 ºС. В глубине агара вырастают черные колонии, разрывающие среду в следствии газообразования. В приготовленных из этих колоний мазках Cl.рerfringens определяются в виде характерных грам-положительных палочек. Другой метод определения Cl. рerfringens в почве производится с использованием сульфит-полимиксиннеомициновой среды (СПН). Инкубация посевов проводится при 44-45 ºС в течение 10-12 часов. Дальнейшая идентификация выросших колоний не требуется. Определение сальмонелл и шигелл.
В подготовленную суспензию почвы вносят растворы и навески магниевой среды в отношении 1:1. Посевы инкубируют при 37 ºС. Через 18-20 часов производят высев петлей на 3-5 чашек висмутсульфитного агара. Дополнительная идентификация проводится по общепринятой методике. Концентрацию микробов при исследовании в ней шигелл и сальмонелл можно проводить с помощью мембранных фильтров. После того как пропустили определенное количество почвенной суспензии, каждый мембранный фильтр накладывают на чашку с дифференциальной средой и размазывают шпателем осадок с фильтра по всей чашке. Посевы выращивают при 37 ºС. Исследование почвы на наличие Clostridium tetani Пробы почвы 20-30 г. собирают в стерильную посуду, затем растирают в стерильной ступке 3-5 г, разводят 10-15 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида. После отстаивания в течение 3-4 часов при комнатной температуре полученную взвесь вносят в количестве 1 мл белым мышам подкожно в правую заднюю конечность. Каждую пробу испытывают на двух мышах. В качестве контроля берут мышей, которым до введения почвенной взвеси было введена противостолбнячная сыворотка. Гибель первой группы мышей с характерными симптомами и выживание контрольных животных указывает на наличие Cl. tetani в почве. Определение Clostridium bоtulinum в почве производят растирая в стерильной фарфоровой ступке 20-30 г почвы, затем переносят в колбу с 80-100 мл среды Китта-Тароцци. Одну из колб при этом прогревают до 80 ºС в течение 30 мин. для уничтожения неспорообразующих микроорганизмов. Прогретую и непрогретую колбы ставят в термостат при температуре 37 ºС на 8-14 дней, после чего из среды обогащения проводят посев в агар столбиком или на чашки с сахарным агаром с дальнейшим изучением биологических и антигенных свойств полученных культур по методам, описанным для клостридий. Методы санитарно-микробиологического анализа воды. Определение микробного числа воды предполагает исследование общего количества мезофильных аэробов и факультативных анаэробов в 1мл. исследуемой воды, способных при 37 ºС в течение 24 часов образовывать на МПА колонии, видимые невооруженным глазом и при увеличении в 2-5 раз. В зависимости от степени загрязнения воды готовят последовательно ее 10-кратные разведения от 1:10 для чистых до 1:10000 для сильнозагрязненных сточных вод. При исследовании водопроводной воды в каждую из двух чашек вносят по 1мл. неразведенной воды и заливают 10-12 мл растопленного и остуженного до 45 ºС МПА, а для выявления роста грибов – сусло-агара. Посевы на МПА выращивают в течение суток при 37 ºС, а на сусло-агаре – 2-3 суток при 27 ºС. Учет колоний производится с использованием лупы, на чашках, где выросло не более 300 колоний. Микробное число питьевой воды централизованного водоснабжения не должно превышать 100 микробных клеток в 1 мл. Определение кишечных палочек обычно проводят с использованием метода титрации – двухэтапный бродильный метод и метода мембранных фильтров. Анализ воды проводят согласно ГОСТа 18963-73 в трех параллельных рядах, начиная с 10; 1 и 0,1 мл. Для объемов 10 мл используют флаконы по 100 мл лактозно-пептонной среды. Все остальные объемы воды вносят в пробирки с 5 мл питательной среды. На выходе в водопроводную сеть в водопроводной воде исследуют три объема по 100 мл воды, три объема по 10 мл воды и три объема по 1 мл. Для этого осуществляют посевы по 100 мл воды на концентрированную глюкозопептонную среду и по 10 мл и по 1 мл воды на разведенную среду. Культивирование посевов производят при 38ºС в течение 24 часов. В случае отсутствия помутнения среды и образования газа через сутки, дается отрицательный ответ. При наличии помутнения среды кислоты и газа из такого флакона производят посев секторами на чашки со средой Эндо, чтобы получить изолированные колонии. Если через 16-18 часов на среде выросли темно-красные с металлическим блеском или без него колонии, из них готовят мазки и проводят пробу на оксидазу. Для этого со среды Эндо снимают по 2-3 колонии каждого типа и наносят на фильтровальную бумагу, смоченную диметил-n-фенилендиамином. Наличие в мазках граммотрицательных палочек и отсутствие оксидазы свидетельствует о положительном результате исследований, которые выражают в виде коли-индекса, т.е. количества бактерий кишечных палочек в 1 л воды. Для питьевой воды централизованного водоснабжения коли-индекс не должен быть больше трех. При определении свежего фекального загрязнения из трех объемов лактозо-пептонной среды, в которых после инкубации при 37ºС в течение 24 часов наблюдалось выделение газа, петлей материал высевают в лактозную среду с борной кислотой. Культивирование на элективной среде производят при 43ºС в течение суток. Наличие газа и помутнений среды указывает на свежее фекальное загрязнение воды. Если среда только помутнела без газообразования, результат не учитывается. Определение индекса фекальных кишечных палочек и бактерий группы кишечных палочек проводят по таблице 2. Таблица 2 Определение индекса бактерий группы кишечных палочек
Метод мембранных фильтров предполагает фильтрование воды в количествах 100, 10 и 1 мл для чистой воды и 0,1; 0,01 мл для загрязненных вод. Начинают исследования с больших разведений. При посевах объемом 1 мл и меньше их разводят в 10 мл стерильной водопроводной воды, а затем фильтруют. После окончания фильтрации изучаемого объема мембранные фильтры снимают стерильным пинцетом и помещают на поверхность среды Эндо фильтрующей поверхностью вверх. На одну чашку помещают до 3-4 мембранных фильтров. Инкубируют чашки с фильтрами при 37 ºС в течение 18-24 часов. Для учета колоний выбирают фильтры с количеством колоний от 10-50. Для расчета коли-индекса количество бактерий группы кишечных палочек, выросшие в анализируемом объеме воды, умножают на 1000 и делят на этот объем. Следует отметить, что методом мембранных фильтров обычно определяется меньшее число бактерий, чем методом титрации. Определение энтерококков Дополнительным показателем фекального загрязнения являются энтерококки (Streptococcus faecalis и др.) индекс энтерококков в исследуемой воде определяют в параллельных рядах посевов в жидкой щелочно-полимиксиновой среде с 10-кратными разведениями в зависимости от предполагаемого бактериального загрязнения воды от 100 до 0,01 мл. Объемы воды по 100 и 10 мл вносят в щелочную-полимиксиновую среду двойной концентрации, остальные объемы – в пробирки со средой обычной концентрации, учет производят после 24 часов инкубации при 37 ºС по изменению цвета и помутнению среды. Из этих флаконов проводят высев секторами на чашки с молочно-ингибиторной средой. Также осуществляют дополнительный учет. Фекальный стрептококк растет на секторах чашек в виде черных с металлическим блеском колоний. Определение патогенных бактерий Определение сальмонелл. Посев исследуемой воды проводят в среды накопления (магниевая, селенитовая среда). Дальнейший ход исследований проводится по общепринятой для сальмонелл методике. Определение шигелл. Шигеллы можно определить в водопроводной воде в случае аварийных ситуаций. В качестве среды накопления при этом используют среду с охмеленным суслом (400 мл исследуемой воды вносят в флакон со 100мл охмеленного сусла). После выращивания в течение суток при 37 ºС производят высев на среду Плоскирева или Левина. Дальнейший ход исследований соответствует методам, описанным в разд. “Лабораторная диагностика бактериальной дизентерии”. Определение энтеровирусов. Вирусологические исследования воды производят при оценке качества водопроводной воды и определении эффективности очистки сточных вод. Метод фильтрации Пробу воды в количестве 1 л фильтруют через мембранный фильтр №3, предварительно доведя рH среды до 3,0 добавлением 1Н. HCl. В качестве элюирующего раствора для снятия энтеровирусов с поверхности фильтра используют мясную воду или МПБ с рH 7,8 (добавлением 1N NaOH). В элюирующую жидкость добавляют антибиотики. После встряхивания в шюттель-аппарате в течение 30' элюат собирают в пенициллиновые флаконы, обрабатывают эфиром и хранят при - 20 ºС. Дальнейшее исследование проводят на культуре клеток. Санитарно-бактериологический анализ воздуха закрытых помещений проводят методом оседания на чашки (седиментация) и аспирационным способом с помощью прибора Кротова. Метод седиментации. В помещениях, где производят микробиологический анализ воздуха устанавливают открытые чашки с МПА на 10мин. Затем чашки закрывают и инкубируют в термостате при 37ºС 24 часа и при комнатной температуре 24 часа. После чего подсчитывают количество выросших колоний, измеряют диаметр чашки с целью определения ее площади. Чтобы найти количество микроорганизмов в 1м3 воздуха, число выросших колоний умножают на множитель таблицы 3 Таблица 3
Метод аспирации по Кротову Поскольку при использовании метода седиментации могут быть определенные погрешности, связанные с тем, что оседание микроорганизмов зависит от потоков воздуха, для более точной оценки количества микрофлоры в 1м3 воздуха используют аспирационный метод с помощью прибора Кротова. С помощью центробежного вентилятора воздух всасывается через щель в крышке прибора. Щель располагается по радиусу чашки Петри, закрепленной на диске, вращающемся со скоростью около 1 оборота в секунду. В результате этого происходит равномерный посев микроорганизмов, находящихся в воздухе на поверхность питательной среды чашки Петри. Время просасывания воздуха обычно 2 мин., скорость – 20-25 метров в минуту. Определение числа микроорганизмов в 1 м3 воздуха производят по формуле:  ,где Х – число м/о в 1м3 воздуха, а – количество колоний выросших в течении 48 часов на чашке Петри, в – количество воздуха пропущенного через щель прибора в л, приведенного к нормальным условиям. Для оценки микробной чистоты воздуха, полученные данные сравниваются с данными таблицы 4. Таблица 4 Характеристика бактериального загрязнения воздушной среды (А.И.Шафир)
Задания к лабораторному занятию
Тема: Микрофлора организма человека Цель: Изучение методов исследования нормальной микрофлоры организма. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
0