Общая микробиология. Виды микроскопии назначение и принципы применения
 Скачать 1.57 Mb.
|
|
Чаще для оценки функционального состояния Т-лимфоцитов в клинической лабораторной практике используют фитогемагглютинин (ФГА) – растительный лектин, получаемый из семян фасоли. Обычно мононуклеарные лейкоциты, выделенные из периферической крови методом градиентного центрифугирования, культивируют в присутствии ФГА в течение 72 ч. Результаты реакции можно учитывать либо морфологическим методом, либо по включению радиоактивной метки. В первом случае из клеточной культуры готовят мазки, фиксируют их в метаноле и окрашивают по Романовскому-Гимза, так же, как мазки крови. В световом микроскопе с иммерсионной системой определяют процент бластов по отношению к общему количеству лимфоцитов. Результат может быть выражен также в виде индекса стимуляции (ИС), представляющего собой отношение процента трансформированных клеток в опыте (культура с ФГА) к проценту трансформированных клеток в контроле (культура без ФГА). Учет результатов по включению радиоактивной метки более удобен. Этот метод позволяет уменьшить количество крови для исследования, а также сократить расход питательных сред и трудозатраты. Культивирование проводят не в пробирках или флаконах, а в 96-луночных планшетах с объемом лунки около 200 мкл. В каждую лунку достаточно внести 50000 клеток, что в пересчете на цельную кровь составляет 0,05 мл. За 4-6 ч до окончания культивирования в лунки вносят зН-тимидин. Далее с помощью специального прибора (клеточного харвестера) клетки переносят на стеклянные фильтры, избыток метки смывают большим количеством воды, фильтры высушивают и помещают во флаконы со сцинтилляционной жидкостью. Уровень включения метки оценивают на сцинтилляционном спектрофотометре. Результаты выражают в импульсах в минуту или в виде индекса стимуляции (отношение уровня включения метки в культуре с ФГА к уровню включения метки клетками, культивировавшимися без ФГА). На интенсивность стимуляции лимфоцитов могут влиять условия культивирования, качество использованных реактивов, качество сыворотки, используемой в качестве добавки к питательной среде. При оценке результатов РБТЛ следует обращать внимание, как на интенсивность пролиферативного ответа стимулированной культуры, так и на высоту ответа в контрольных лунках. Снижение пролиферативного ответа на ФГА свидетельствует о наличии иммунодефицита, однако механизмы последнего могут быть различны. Оценка интенсивности продукции цитокинов С помощью тестов этой группы можно получить представление о продукции цитокинов мононуклеарными лейкоцитами периферической крови. Следует иметь в виду, что одни цитокины продуцируются преимущественно лимфоцитами (ИЛ-2, ИЛ-6), а другие – моноцитами (ИЛ-1, TNF); продукцию первых стимулируют Т-клеточные митогены (ФГА, Кон А), продукцию вторых – микробные липополисахариды (ЛПС). Исследование проводят по следующей схеме. Мононуклеары периферической крови, выделенные методом градиентного центрифугирования, культивируют в 24-луночных культуральных планшетах (объем лунки около 2 мл) в течение 16-18 ч в присутствии Кон А, ФГА или ЛПС. Надосадочную жидкость собирают и определяют в ней содержание цитокина. Для определения содержания цитокинов используют либо иммуноферментный анализ, либо цитокинзависимые клеточные линии. Принцип определения основан на том, что клеточная линия способна размножаться только в присутствии определенного цитокина. Интенсивность пролиферации клеток линии в присутствии разных разведений исследуемого образца сравнивают с интенсивностью пролиферации клеток той же линии в присутствии различных разведений рекомбинантного цитокина с известной активностью. Математическое сравнение полученных титровочных кривых позволяет вычислить содержание цитокина в исследуемом образце. В некоторых случаях используют не цитокинзависимую, а цитокинчувствительную клеточную линию. Клетки этой линии гибнут в присутствии цитокина. Таким образом, титровочная кривая будет отражать процент погибших клеток, которых будет тем больше, чем выше концентрация цитокина. Определение специфических IgE обычно проводят с помощью кожных проб. Определение специфических IgE с помощью радиоаллергосорбентного теста показано при высоком риске анафилактических реакций, поражении кожи. Суть метода заключается в следующем:
Применяется модификация метода с использованием меченных ферментом антител к IgE. Методы, основанные на реакции высвобождения гистамина тучными клетками. Суть методов заключается в следующем:
Эти методы могут использоваться для изучения влияния лекарственных средств и других веществ на тучные клетки и базофилы при аллергических заболеваниях. Методы, основанные на реакции высвобождения гистамина тучными клетками, трудоемки и применяются редко. Оценка гиперчувствительности замедленного типа Для оценки гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) используют реакцию торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ), которая по своей сути является пробирочным аналогом клеточных иммунных реакций ГЗТ. В качестве веществ, модулирующих (тормозящих или активирующих) спонтанную миграционную активность лейкоцитов, применяют те же митогены, что и при РБТЛ. Кроме того, могут быть использованы тканевые и микробные антигены, стандартные аллергены. Последние применяют при диагностике саркоидоза, туберкулеза, альвеолитов и других заболеваний, протекающих с образованием эпителиоидноклеточных гранулемм (тканевое выражение ГЗТ). Анализируемые клетки помещают в стеклянные капилляры, которые инкубируют в чашках Петри с культуральной средой с добавлением или без добавления (спонтанный уровень миграции) митогена либо антигена. Сравнение интенсивности миграции в опытной и контрольной чашках позволяет вычислить индекс миграции. Оценка функционального состояния фагоцитов Наиболее доступным объектом для оценки функционального состояния фагоцитов являются нейтрофилы крови. Оценку активности Fc и С3-рецепторов нейтрофилов можно проводить с помощью реакции розеткообразования с зимозаном, нагруженным соответственно анти-Fс-антителами или комплементом при 4ºС. Этот прием позволяет определить долю нейтрофилов, способных к адгезии объекта фагоцитоза. Саму фагоцитарную активность оценивают с помощью методов, позволяющих определить долю клеток, способных формировать фагосому. "Переваривающую " способность нейтрофилов и их антибактериальную активность можно определить непосредственно методом фагоцитоза с перевариванием тестируемого микроорганизма. Для постановки реакции фагоцитоза к 1 мл суспензии фагоцитов, к которому было добавлено 8 МЕ гепарина, приливают 1 мл суспензии бактерий. Время взаимодействия составляет обычно 30 мин. После инкубации отбирают 0,5 мл смеси, добавляют 1,5 мл 0,1% раствора желатина в растворе Хенкса, охлажденного до 0ºС, и центрифугируют 3-4 мин. при 300 g. Из осадка готовят мазки, которые окрашивают по Паппенгейму. Просматривают 200 клеток (по возможности трижды). Вычисляют процент фагоцитоза. По числу содержащихся в клетках бактерий рассчитывают индекс активности фагоцитоза: число фагоцитированных бактерий умножают на процент фагоцитирующих клеток; интенсивность фагоцитоза выражают числами от1 до 4. Степень 1: фагоцитировано 1-4 бактерий. Степень 2: фагоцитировано 5-7 бактерий. Степень 3: фагоцитировано 8-10 бактерий. Степень 4: фагоцитировано более 10 бактерий на клетку. Пример проведения расчета при слабом фагоцитозе. Число просчитанных клеток 500 Число нефагоцитировавших клеток 350 Число клеток, фагоцитировавших 1-2 микроба 104 Число клеток, фагоцитировавших 3-4 микроба 40 Число клеток, фагоцитировавших 5 и более микробов 7 Индекс фагоцитоза 104 х 1,5 = 156 40 х 3,5 = 140 7 х 5 = 35 331 331 : 500 = 0,7 Количество живых микробов определяют по рассеву на плотные питательные среды 0,1 мл исследуемых фракций. Инкубируют 24(48) часов. При расчете бактерицидности исходят из того, что одна образовавшаяся колония соответствует одному живому микробу. Для направленного изучения бактерицидности исследуют кровь пациентов и здоровых доноров с добавлением раствора антибиотиков (по 5000 ЕД пенициллина и стрептомицина/мл) и без него, а также проводят бактериальный контроль. |