Общая микробиология. Виды микроскопии назначение и принципы применения
 Скачать 1.57 Mb.
|
КаАТАГ=КдАТ-АГи рассчитать константу равновесия:  Константа равновесия определяет аффинность – сумма сил притяжения и отталкивания между молекулами, которые возникают при взаимодействии активного центра антитела (его антигенсвязывающей области) и гомологичной антигенной детерминанты. Термин аффинность наиболее пригоден для характеристики первичного взаимодействия антигена с антителом, т.е. взаимодействия одной антигенной детерминанты с одним активным центром антитела. Однако в природе антигены и антитела поливалентны и вступают в более сложные взаимодействия, чем только первичное связывание. Поэтому энергию взаимодействия антител и поливалентных антигенов наиболее объективно характеризует функциональная аффинность, или авидность. Поскольку встречающиеся в природных условиях антигены поливалентны, очевидно, что в имунном ответе организма более важную роль играет функциональная афинность. Поливалентное связывание антител в энергетическом отношении выгодней, чем моновалентное, поскольку оно более прочное и имеет явные функциональные и биологические преимущества – для обеспечения активного гуморального иммунитета требуются меньшие концентрации поливалентных антител, чем моновалентных. Реакция между антителом и антигеном протекает в две стадии, первая из которых специфическая (непосредственное соединение активного центра антитела с антигенной детерминантой), вторая – неспецифическая, когда отличающийся плохой растворимостью имунный комплекс антиген-антитело выпадает в осадок. Неспецифическая стадия, как правило, осуществляется в присутствии растворов электролитов и визуально проявляется по-разному в зависимости от физического состояния антигена. В основе иммунологической специфичности, т. е. избирательности реакции определенного антигена с соответствующим ему антителом, лежит структурная комплементарность (стерическое и химическое соответствие) антитела и антигена. Для возникновения сил притяжения эти два компонента системы должны сблизиться своими реагирующими поверхностями на расстояние не более 0,1…0,2 нм. Существенную роль в реакциях на 1-й стадии играет взаимодействие неполярных (гидрофобных) молекул с водной средой. Контакт этих молекул с молекулами воды ослабевает вследствие стремления гидрофобных групп к ассоциации. В результате возникает неполярное (гидрофобное) связывание и система антиген-антитело стабилизируется, что и приводит к появлению сил притяжения. Сила неполярных взаимодействий возрастает с температурой, так как возникновение этих взаимодействий является эндотермическим процессом. Межмолекулярные взаимодействия антигена и антитела обусловлены также кулоновскими (ионными) силами, т.е. взаимным притяжением положительно (группа NН3+) и отрицательно (группа СОО-) заряженных токовых цепей иммуногена и стимулированного им антитела. Чем больше соответствие полярных групп реагирующих молекул, тем прочнее комплекс антиген-антитело. Стерические силы отталкивания возникают между атомами при взаимном проникновении их электронных облаков. Чем комплементарней электронные облака, тем меньше силы отталкивания. Стерические силы отталкивания важны для сохранения прочности комплекса антиген-антитело, так как именно они определяют степень соответствия между антигенной детерминантой и активным центром антитела. Реакция, происходящая между антителами и антигеном и начинающаяся быстрым соединением детерминантной группы антигена со специфическим активным центром антитела (1-я стадия), осложняется далее образованием длинных цепей из чередующихся молекул антигена и антител, а также разветвлением этих цепей (2-я стадия). Во второй стадии реакции происходит образование решетки антиген-антитело. Необходимое условие образование решетки - наличие более трех антигенных детерминант на каждую молекулу антигена и по два активных центра на каждую молекулу антитела. На рис.1 изображены варианты соединения молекул антител с молекулами антигена. Молекулы антигена являются узлами решетки, а молекулы антител – связующими звеньями. В зоне избытка антител (рис.1а,б) часть антигенсвязывающих участков свободна и формирование комплекса тормозится. Область оптимальных соотношений (зона эквивалентности) концентраций антигена и антител, когда в надосадочной жидкости после образования осадка не обнаруживаются ни свободные антигены, ни свободные антитела, представлена на рис.1в. В зоне же избытка антигена (рис.1г,д) комплекс антиген-антитело растворяется, так как свободные и связанные в решетку молекулы антигена конкурируют между собой за двухвалентные молекулы антител, в результате чего решетка распадается на ряд растворимых комплексов типа АГ-АТ-АГ. Окончательное формирование системы антиген-антитело протекает намного медленнее, чем 1-я стадия реакции. Это неспецифический процесс, в который могут включаться различные посторонние белки, захватывающиеся решетчатой структурой антиген-антитело и неспособные диффундировать сквозь узкие петли этой решетки в надосадочную жидкость. Скорость образования решетки зависит от температуры, ионной силы раствора и других условий. Оптимальными условиями реакции антиген-антитело in vitro считаются следующие: t=37ºС; ионная сила 0,05...0,1 и рН 6,4...8,6. Определение аффинности антител Для определения аффинности антител предложено много методов:
Метод осаждения сульфатом аммония. Принцип метода. Для оценки аффинности необходимо определение свободного (с) и связанного (в) гаптена. Иммуноглобулины осаждаются в мягких условиях из раствора при 33-55% насыщения сульфатом аммония без потери сродства к гаптену. Затем измеряется количество гаптена, связанного находящимися в осадке антителами и свободного гаптена в надосадочной жидкости. Методика. Используют очищенные антитела или антисыворотку. Очищенные антитела растворяют в нормальной сыворотке, разведенной в соотношении 1:5 или 1:10, обладающей низким сродством к соответствующему гаптену. Исследуемые антисыворотки также разводят в соотношении 1:5 или 1:10. К 50 мкл раствора антител приливают пипеткой 50 мкл раствора гаптена. В качестве контроля неспецифического связывания используют нормальную сыворотку в разведении 1:5 или 1:10. В зависимости от необходимой точности определения аффинности применяют 5-20 различных концентраций гаптена, охватывающих область концентраций трех порядков (например, от 10-5М до 10-7М). Оба компонента тщательно перемешивают и выдерживают при 4ºС в течение 1 часа. Затем прибавляют равный объем (100 мкл) насыщенного раствора сульфата аммония при температуре 4ºС и немедленно перемешивают, чтобы избежать денатурации антител. После 30-минутной инкубации при 4ºС, в течение которой дважды проводят кратковременное встряхивание, пробирки центрифугируют в течение 15 минут при 5000 об/мин при той же температуре. Надосадочную фракцию в количестве 100 мкл, в которой определяют концентрацию свободного гаптена, переносят в 10 мл сцинтиллятора. Измеряют радиоактивность образца с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. Количество свободного гаптена (с) определяют непосредственно по радиоактивности материала. Количество связанного с антителами гаптена (в) вычисляют по разности между радиоактивностью надосадочной фракции раствора, содержащего специфические антитела, и раствора, содержащего нормальную сыворотку. Если концентрация антител известна то, в может быть преобразовано в молярное соотношение Г/АТ. Метод равновесного диализа Принцип метода.Раствор антител известной концентрации приводится в соприкосновение с раствором гаптена через полупроницаемую мембрану. Оба компонента растворены в одинаковом буфере для того, чтобы исключить разницу рН и ионной силы. Молекулы антител не проходят через мембрану, молекулы гаптена диффундируют через нее в раствор антител и частично связываются с ними. Состояние равновесия достигается, когда концентрация свободного гаптена становится одинаковой по обе стороны мембраны. Время диффузии зависит от проницаемости мембраны, природы гаптена и температуры. Измерив концентрацию свободного гаптена по обе стороны мембраны, можно определить количество гаптена, связанного с антителами. Основные методы выявления антител и антигенов Методы определения антител и антигенов основаны на различных способах регистрации их взаимодействия. С некоторой степенью условности их можно разделить на следующие группы:
Методы, основанные на реакции преципитации Основная модель реакции антиген-антитело представлена преципитацией, в ходе которой антиген из раствора осаждается специфическими антителами. Комплекс антиген-антитело выпадает в осадок только при определенных соотношениях концентраций реагирующих молекул. Область этих соотношений, при которых в надосадочной жидкости после образования преципитата не обнаруживаются ни свободные антигены, ни свободные антитела, называется зоной эквивалентности. Вне этой зоны, когда существует избыток антител или антигена, феномен преципитации не развивается, так как образуется растворимый комплекс антиген-антитело. Если в пробы с постоянной концентрацией антител добавлять возрастающие количества антигена и в образовавшихся, отмытых физиологическим раствором преципитатах определять содержание азота микрометодом Къельдаля, можно получить количественное выражение реакции преципитации. В зависимости от вариантов постановки преципитации выявляемое количество антител колеблется от 2 до 18 мкг азота белка антител в 2 мл. Существуют различные модификации постановки реакции преципитации. Самый простой способ – кольцепреципитация. Методика. В узкую пробирку (диаметр 0,5 см) наливают 0,3-0,5 мл неразведенной преципитирующей сыворотки. Пастеровской пипеткой медленно наслаивают по стенке (пробирку держат в наклонном положении) антиген в таком же объеме. Затем пробирку осторожно, чтобы не смешать жидкости, ставят вертикально. При правильном наслоении антигена на сыворотку четко видна граница между двумя слоями жидкости. РП должна обязательно сопровождаться контролями сыворотки и антигена (рис.8.1) Результаты реакции учитывают в зависимости от вида антигена и антител через 5-10 мин, 1-2 ч или через 20-24 ч. В случае положительной реакции в опытной пробирке на границе между сывороткой и исследуемым экстрактом появляется преципитат в виде кольца белого цвета. Реакция преципитации широко применяется в лабораторной практике для диагностики инфекционных заболеваний бактериальной этиологии (сибирская язва, чума, острая респираторная инфекция и др.). В судебной медицине РП используется для определения видовой принадлежности белка (кровавых пятен, спермы и т.д.). С помощью РП можно выявить не только видовую, но и групповую специфичность белка. С ее помощью, например, была определена степень родства различных видов животных и растений. Применение РП для санитарно-гигиенического контроля пищевых продуктов позволяет выявить фальсификацию мясных, рыбных, мучных изделий, примеси в молоке и т.д. Реакция преципитации может быть поставлена в агаровом геле (иммунодиффузия). Различают простую и двойную иммунодиффузию. В первом случае диффундирует один компонент реакции, во втором оба. В зависимости от того происходит ли диффузия по одной общей оси, во все стороны радиально или под углом иммунодиффузия называется линейной, радиальной или угловой. Общая схема методов представлена на рис. 2. Двойная радиальная иммунодиффузия Принцип метода. В лунки, вырезанные в агаровом или агарозном геле, помещают антиген и антисыворотку, которые диффундируют навстречу друг другу. В том участке геля, где их соотношения эквивалентны, образуется видимый преципитат. Двойную радиальную иммунодиффузию проводят на предметных стеклах (микрометод). Методика. Расплавляют 1,5 г агара в 100 мл буфера (0,15 М NaCl) на водяной бане. Порциями по 3 мл горячий агаровый гель наносят на сторого горизонтально установленные предметные стекла, для того чтобы получить равномерный слой агара толщиной приблизительно 1,5 мм. После застывания агара пластинки готовы к употреблению. В зависимости от характера иммунохимических исследований в агаре делают дунки при помощи готовых штампов или вырезают из стеклянной (можно металлической) трубочкой. Лунки должны отстоять друг от друга на расстоянии от 4 до 10 мм. В одни лунки вносят сыворотку, в другие – антигены. После внесения растворов иммунодиффузию проводят во влажной камере при температуре 4, 20 или 37С. Продолжительность диффузии зависит от целей исследования, она должна быть не менее 24 часов и в некоторых случаях может достигать 6-7 дней. По окончании иммунодиффузии можно непосредственно оценивать результаты по влажному препарату. Возможен другой способ оценки результатов. Для этого нужно сначала отмыть непреципитирующие субстанции замачиванием пластины 2-3 раза на 12 часов в 0,15 М растворе NaCl. Затем на поверхность геля кладут фильтровальную бумагу, смоченную дистиллированной водой, и гель высушивают при 40-50С или при комнатной температуре. Высушенные пластины геля окрашивают обычно амидочерным 10В, после чего оценивают результаты иммунодиффузии. Принципиально возможны четыре варианта расположения линий преципитации:
Основные типы преципитации представлены на рис. 3. Вышеописанная методика иммунодиффузии на предметных стеклах представляет собой микровариант метода, предложенного Ухтерлони в 1949 г. В условиях макрометода слой геля, создаваемый в чашках Петри, составляет 2-3 мм, лунки и соответственно объемы реагентов довольно велики, лунки отодвинуты друг от друга на значительные расстояния, линии преципитации длинные и хорошо выраженные. Титрование. Для титрования растворов антигена и антисыворотки располагают лунки так, как показано на рис. 4. Одинаковые объемы растворов антигена, приготовленных двукратным разведением вносят в периферические лунки. Такой же объем антисыворотки вносят в центральную лунку. При оценке иммунодиффузии учитывают:
Наибольшее разведение, при котором образуются видимые преципитаты, дает значение титра. Этим способом можно также определять количество преципитирующих антител в различных антисыворотках, которые можно сравнивать в реакции иммунодиффузии со стандартным раствором антигена. Полуколичественное определение антигенов. Титрование часто используют для полуколичественного определения антигена. Вокруг центральной лунки с антисывороткой формируют четыре лунки для антигена. Чем выше концентрация антигена, тем ближе к центральной лунке будут расположены полосы преципитации. Путем сравнивания со стандартным раствором антигена можно определить неизвестную концентрацию антигена. |