Общая микробиология. Виды микроскопии назначение и принципы применения
 Скачать 1.57 Mb.
|
Сбор иммунологического анамнеза и характеристика основных иммунопатологических синдромовСбор иммунологического анамнеза проводят в соответствии с картой иммунологического опроса. В результате опроса следует сразу определить тип наиболее вероятного иммунопатологического синдрома. Как правило, речь идет об одном из следующих 6 синдромов:
Диагностические тесты, проводимые непосредственно у больного(тесты in vivo)Тесты этой группы включают кожные тесты (капельные уколочные и др.), провокационные пробы (эндоназальные, полоскательный тест, ингаляционные тесты ) и элиминационные пробы. Наибольшее распространение получили кожные тесты. Следует помнить, что проведение тестов in vivo всегда имеет ряд противопоказаний, особенно у детей. К таким противопоказаниям прежде всего относятся:
Следует помнить и о вероятности ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Первые могут возникнуть при повышенной чувствительности к механическому раздражению и компонентам разводящей жидкости или при наличии перекрестных реакций. Получение ложноотрицательного результата может быть связано с нарушением техники постановки проб, отсутствием или истощением реагинов в коже, предшествующих приему антимедиаторных препаратов, если есть аллергия другого типа. Иногда применяют холодовую пробу (прикладывание кусочков льда), тепловую пробу (прикладывание грелки с температурой 40-42ºС, а также кратковременную локальную инсоляцию (при подозрении на фотодерматиты ). Основные тесты лабораторной иммунодиагностикиВсе существующие в настоящее время лабораторные иммунологические тесты могут быть разделены на тесты I и II уровня. Тесты 1 уровня (ориентирующие) включают:
После анализа результатов тестов первого уровня определяют тактику дальнейшего исследования иммунного статуса. Тесты второго уровня в отличие от тестов первого уровня ставят избирательно в зависимости от того, какие цели преследует проводимое иммунологическое обследование. Тесты 11 уровня могут включать :
Методы исследования лимфоцитовКак правило, исследование лимфоцитов в лаборатории включает этап выделения фракции мононуклеарных лейкоцитов из периферической крови. С этой целью используют метод градиентного центрифугирования . Кровь больного ( кровь берут из вены в раствор гепарина) разводят в два раза забуференным изотоническим раствором натрия хлорида, не содержащим ионов Мg и Ca, и осторожно наслаивают на раствор фикола. В последний для увеличения его плотности добавляют рентгеноконтрастный препарат для внутривенного введения (например, верографин, гипак, триозил и др.) В результате между плазмой и раствором фикола образуется ступенчатый градиент плотности. После центрифугирования эритроциты и гранулоциты проходят сквозь фикол и оседают на дно, а мононуклеары (лимфоциты и моноциты) остаютсся в виде кольца в интерфазе. Клетки собирают пипеткой, отмывают, переносят в культуральную среду и исследуют с помощью различных методов. Все методы исследования лимфоцитов можно разделить на изучение поверхностных маркеров и функциональные тесты. В 1983 году Первое международное рабочее совещание по антигенам дифференцировки лейкоцитов ввело в практику клинической иммунологии термин ''clusters of differentiation” (кластеры дифференцировки, сокращенно СД). Методы, основанные на изучении поверхностных маркеровВ настоящее время для идентификации поверхностных структур лимфоцитов и ряда других клеток в основном используют 3 группы методов:
Наиболее дешевым и в то же время достаточно точным методом определения численности популяции Т- лимфоцитов является метод розеткообразования. Метод основан на наличии сродства между рецептором СD2 и гликопротеинами мембраны эритроцита барана. При смешивании лимфоцитов с эритроцитами барана образуются фигуры, получившие название розеток. Количество таких розеткообразующих клеток (Е-РОК) соответствуют количеству Т-лимфоцитов, для которых характерна экспрессия на поверхности СD2 – антигена. Другая модификация метода розеткообразования (ЕАС-розетки) используется для идентификации В-клеток. Известно, что на поверхности В-лимфоцитов имеется рецептор для С3-компонента комплемента. Для выявления этого рецептора лимфоциты смешивают с эритроцитами быка, последовательно обработанными антиэритроцитарными антителами в субагглитинирующей концентрации и комплементом (свежезамороженной сывороткой крови мыши). Использование такого источника комплемента гарантирует защиту эритроцитов от комплементзависимого лизиса. После совместной инкубации В-клетки образуют фигуры розеток. Более прогрессивным является использование метода иммунофлуоресценции, который позволяет с помощью наборов моноклональных антител к различным СD-антигенам идентифицировать практически любые поверхностные структуры лимфоцитов. Различают метод прямой и непрямой иммунофлуоресценции. Первый состоит в использовании анти-СD–моноклональных антител, к которым присоединена флуоресцентная метка. Чаще применяют флуоресцеин изотиоцианат (ФИТЦ), дающий в ультрафиолетовых лучах зеленоватое свечение. При наблюдении в люминесцентном микроскопе клеток, обработанных мечеными антителами, можно видеть характерные светящиеся ободки, указывающие на то, что на поверхности данной клетки экспрессированы соответствующие дифференцировочные антигены. Метод непрямой иммунофлюросценции предполагает использование немеченых моноклональных антител. Визуализация реакции осуществляется с помощью вторых антител (например, козьи антитела против иммуноглобулина мыши, если моноклональные антитела были получены на основе мышиной гибридомы), несущих флуоресцентную метку. Применение иммуноферментного метода, когда ко вторым проявляющимся антителам вместо ФИТЦ присоединяется пероксидазная метка, особенно удобно для небольших иммунологических лабораторий, так как не требует дорогих люминесцентных микроскопов. Цветную реакцию, возникающую при взаимодействии фермент-субстрат, можно наблюдать в обычный световой микроскоп. Универсальным методом исследования лейкоцитов является метод лазерной проточной цитофлуориметрии, который позволяет не только получить детальные характеристики клеточных субпопуляций, но производить их препаративное разделение. Прежде всего, на основе анализа светорассеивания (без применения антител) в исследуемом образце можно определить содержание лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов. Используя метод иммунофлуоресценции (прямой или непрямой), можно определить численность различных субпопуляций лимфоцитов. Помимо регистрации свечения, возможна оценка его интенсивности. Обработка полученных данных по специальной программе позволяет вычислить плотность данного рецептора на клеточной мембране. За ограниченный отрезок времени можно произвести больше число анализов. Помимо определения численности популяций и субпопуляций , важное значение придается вычислению показателя СД4/СД8-так называемого хелперно-супрессорного отношения. Определение соотношения лимфоцитов с хелперной и супрессорной функциями допустимо производить в теофиллиновом тесте. Принцип метода заключается в том, что в присутствии теофиллина Т-лимфоциты с супрессорной функцией теряют способность к Е-розеткообразованию. Такие клетки получили название теофиллинчувствительных (ТЧ). Так называемые теофиллинрезистентные (ТР) клетки в значительном проценте случаев содержали субпопуляцию Т-лимфоцитов с хелперной активностью. Показатель ТР/ТЧ в норме составляет 2,5 – 3,5. Исследование функционального состояния лимфоцитовСуществует большое число методов, позволяющих исследовать in vitro различные функции лимфоидных клеток. В частности, в клинических иммунологических лабораториях исследуют интенсивность пролиферативного ответа лимфоцитов на Т- и В-клеточные митогены, продукцию антител, а также синтез мононуклеарами периферической крови цитокинов. Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) Известны вещества, оказывающие на лимфоциты млекопитающих митогенное действие (табл. 1). Таблица 1 Неспецифические митогены лимфоцитов
|