Общая микробиология. Виды микроскопии назначение и принципы применения
 Скачать 1.57 Mb.
|
Состав пробы: 0,3 мл раствора Хенкса +0,1 мл нормальной сыворотки, полученной из крови, взятой у пяти доноров + 0,5 мл суспензии лейкоцитов (107 кл/мл) + 0,1 мл суспензии микробов (106 мкб/мл). Раствор антибиотиков вносят по 0,02 мл в пробу. Инкубируют пробы при 37оС и определяют число микробов через 20 минут, 1,5 часа и 3 часа. Для этого отбирают по 0,1 мл из каждой пробы, разводят отобранные аликвоты раствором Хенкса в 10, 100 и 1000 раз и наносят на подогретый агар. Если хотят сократить длительность бактериологического исследования, можно определять находящиеся внутри клетки микробы по флуоресценции при помощи окраски акридиновым желтым. Процесс фагоцитоза можно исследовать in vivo. Для этого белым мышам вводят внутрибрюшинно 3 мл стерильного МПБ, через 2-4 часа – 1 мл микробной взвеси S.saprophyticus в изотоноческом растворе хлорида натрия по стандарту, содержащему 2 млрд. микробных клеток в 1 мл. Через 10, 30, 60 минут после этого брюшную стенку мыши прокалывают тонким капилляром пастеровской пипетки, набирают в нее несколько капель экссудата и делают мазки на стеклах, предварительно обезжиренных в смеси Никифорова. Мазки высушивают, фиксируют в смеси Никифорова 10 минут, окрашивают по Романовскому-Гимза 30 минут. При микроскопии отмечают отдельные стадии фагоцитарного процесса: прилипание, поглощение, частичное переваривание. Подсчитывают индекс фагоцитоза в динамике. Если он со временем убывает, то это свидетельствует о том, что фагоциты переваривают поглощенные ими клетки ( завершенный фагоцитоз ). Если индекс фагоцитоза с течением времени не изменяется или возрастает, то это свидетельствует о незавершенном фагоцитозе. В последние годы большое распространение получили методы оценки АФК (активные формы кислорода) в НСТ-тесте или с помощью хемолюминесценции. Методы основаны на способности ассоциированных с плазматической мембраной оксидаз восстанавливать кислород с образованием супероксид-анионов или перекиси водорода. Есть основание предполагать, что активация кислородного обмена может служить индикатором процесса захвата. Для проведения НСТ-пробы - пробы на восстановление нитросинего тетразолиевого до формазана смешивают 0,1 мл крови 0,1 мл 0,1% раствора НСТ в 0,15М NaCl, инкубируют 20 минут при 37оС, еще раз тщательно перемешивают. Включение формазана в клетки определяют микроскопией. Результат выражают в процентах формазан-позитивных клеток. Формазан-позитивными клетками считаются клетки с гранулами и включениями синего цвета. Миграционную активность фагоцитов оценивают в тестах РТМЛ и направленного хемотаксиса. Определение комплемента. Комплемент – это группа сывороточных белков, состоящая из протеаз и их активаторов. Существуют два механизма активации комплемента – классический и альтернативный. Комплемент играет важную роль в защите от микробов, активирует катаболизм циркулирующих иммунных комплексов и участвует в регуляции функций иммунной системы. В клинической практике невозможно обходиться без определения содержания комплемента и его компонентов в сыворотке крови. Это касается как патологии со сниженной активностью комплемента, так и случаев повышения его активности. Определение гемолитической активности комплемента. Для исследования компонентов классического пути активации комплемента определяют его гемолитическую активность. Суть метода заключается в следующем:
Существуют модификации метода, основанные на применении небольших объемов исследуемой сыворотки. Определение гемолитической активности комплемента по 100% гемолизу основано на гемолизе в геле. Суть этого метода заключается в следующем:
Определение гемолитической активности комплемента позволяет обнаружить недостаточность компонентов комплемента, прежде всего участвующих в образовании мембраноатакующего комплекса. Кроме того, оценка этого показателя может использоваться для выявления активации комплемента, например при СКВ и гломерулонефрите, хотя чувствительность метода для этого недостаточно высока. Альтернативный путь активации комплемента исследуют редко. Определение компонентов комплемента обычно проводят при обследовании больных с аутоиммунными заболеваниями и при подозрении на генетический дефект комплемента. Количественное определение компонентов комплементачаще (С3 и С4) проводят с помощью простой радиальной иммунодиффузии и нефелометрии. Однако если функциональный дефект компонентов комплемента не сопровождается изменением их антигенных свойств, эти методы не информативны. Функциональные исследования позволяют оценить активность отдельных компонентов комплемента в сыворотке. Суть метода заключается в следующем:
Иногда дополнительно оценивают активность регуляторных компонентов комплемента, например ингибитора Cl-эстеразы. Задания к лабораторному занятию
Тема: Реакции антиген – антитело. Цель: знать химические основы реакций иммунитета; освоить методики постановки реакций кольцепреципитации, развернутой реакции агглютинации. Вопросы для самоподготовки
Литература
Реакции антиген-антитело. Химические основы В основе реакций иммунитета лежит специфическое соединение антигена с соответствующим антителом в комплексе ( реакция антиген-антитело). В результате взаимодействия антигена с антителом происходят конформационные изменения молекулы антитела, обусловленные сближением определенных областей его молекул, возникновением новых областей или маскировкой некоторых из них. Схематически эту реакцию можно выразить следующим образом: АТ+АГ  АТ-АГ,где АТ – свободное антитело; АГ – свободный антиген; АТ-АГ – комплекс антиген-антитело; Ка – константа ассоциации; Кд – константа диссоциации. Пользуясь законом действующих масс, уравнение можно видоизменить: |