Общая микробиология. Виды микроскопии назначение и принципы применения

• Название: Виды микроскопии назначение и принципы применения
• Анкор: Общая микробиология.doc
• Дата: 12.12.2017
• Размер: 1.57 Mb.
• Имя файла: Общая микробиология.doc
• Тип: Литература; #11046
• страница: 29 из 40

Простая радиальная диффузия

Принцип метода. Этот метод отличается более высокой чувствительностью, чем предыдущий, так как антисыворотка входит в состав агара, в который из лунки диффундирует антиген. По мере удаления от лунки концентрация антигена постепенно падает, пока не становится эквивалентной концентрации антител в агаре. Этот метод впервые описал Манчини в 1963 г.

Методика. Растворяют 1,5 г агара в 100 мл буфера (0,15М NaCl) на водяной бане, охлаждают до 48^оС и смешивают с АС, желательно подогретой до той же температуры, в небольшой пропорции. Наносят пипеткой 2 мл смеси на предметное стекло, установленное строго горизонтально на подставке, нагретой до 35-40^оС. Золь агара, содержащий антитело, распределяется по поверхности предметного стекла и застывает слоем, толщиной 1 мм. На предметном стекле в слое геля вырезают по 8 лунок при помощи стеклянной трубки, соединенной с водоструйным насосом (таким образом создают пониженное давление). В каждую из лунок вносят по 2 мкл раствора антигена. Реакцию простой радиальной иммунодиффузии проводят во влажной камере. Если линии преципитации достаточно выражены, оценку результатов можно проводить прямо на влажной пластинке. В других случаях, пластинки с гелем отмывают 2-3 раза в 0,15 М NaCl; каждая отмывка длится 12 часов. Этим достигается удаление непреципитированных белков. После отмывки препараты высушивают и окрашивают, например, амидо черным 10В. При этом образуется хорошо различимое кольцо преципитации. Чем выше концентрация внесенного антигена, тем больше диаметр кольца. Если в реакции используется несколько стандартов с известной концентрацией антигена, то путем сравнения или постройки колибровочной кривой можно проводить количественное определение антигена в образцах.

Для определения титра антител смешивают гель в установочной пропорции с антигеном, антитела диффундируют в гель (обратная радиальная иммунодиффузия). Радиус колец преципитации пропорционален титру.

Иммуноэлектрофорез

Иммуноэлектрофоретический анализ представляет собой сочетание электрофореза в агаровом геле с иммунодиффузией. Существуют различные варианты иммуноэлектрофореза. Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) впервые описан Грабар и Уильямс в 1953 г. В 1955 г. Шейдеггер предложил микромодификацию этого метода, применив обычные предметные стекла.

Принцип ИЭФ состоит в следующем. Вначале проводят электрофоретическое разделение белков (антигенов) в забуференном геле агара; после снятия напряжения вдоль направления движения белков в электрическом поле в геле вырезают канавку, в которую вносят преципитирующую иммунную сыворотку. Антиген и антисыворотка диффундируют в геле навстречу друг другу, и в месте их взаимодействия возникают дугообразные линии преципитации, число, положение и форма которых дают представление о составе исходной смеси антигенов.


С помощью данного метода в клинической иммунологии полуколичественно определяют концентрацию иммуноглобулинов различных классов, идентифицируют миеломные белки. Также ИЭФ используется при диагностике иммунодефицитных состояний. Метод незаменим в последовательном наблюдении за процессом очистки белковых препаратов. Его часто используют также для контроля подлинности и чистоты этих препаратов.

Для разделения сложной смеси антигенов используют двухмерный (перекрестный) электрофорез. Метод включает два этапа. На первом этапе белки диффундируют под влиянием электрического поля в агарозном геле, содержащем антитела. На втором этапе пластину поворочивают на 90^о и подвергают повторный разгонке в направлении, перпендикулярном первому. Таким образом удается количественно охарактеризовать каждый из антигенов смеси. Этот метод, в частности, применяют для оценки степени конверсии белка системы комплемента С3 в инактивированную форму С3с в сыворотке больных СКВ или синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом.

Электроиммунный анализ

Метод впервые был предложен Лореллом в 1966 г. Гель агарозы, содержащий антисыворотку, распределяют равномерным слоем по плоской поверхности. Препарат, содержащий антиген вносят в различных разведениях в серию последовательных лунок в геле. Из лунок под воздействием постоянного электрического тока антигены мигрируют в слой агарозы, где они взаимодействуют с иммуноглобулинами. В результате этого взаимодействия образуются преципитаты АГ-АТ, приобретающие вытянутую, заостренную форму, напоминающую ракету. Отсюда другое название метода – ракетный иммуноэлектрофорез. Длина зоны преципитации при прочих равных условиях (концентрация геля, концентрация антисыворотки в геле, толщина слоя геля, режим электрофореза) находится в прямой зависимости от концентрации антигена. ЭИА используют для количественного определения белков в жидкостях организма.
Встречный электрофорез

Принцип встречного электрофореза применил в 1969 г. Бедарида для обнаружения преципитатов АГ-АТ. Иммунопреципитация происходит в слое носителя, причем в отличие от метода Ухтерлони контакт антигена с антителом происходит не вследствие свободной диффузии, а под влиянием постоянного электрического поля. Белки представляют собой амфолиты; ввиду различий аминокислотного состава они могут мигрировать в щелочной среде с разной скоростью и в разных направлениях (анодном, катодном). Если антиген и соответствующая преципитирующая антисыворотка мигрируют в разных направлениях, становится возможным их движение друг навстречу другу в слое геля или на ацетатцеллюлозной пленке. Преципитация наблюдается между стартовыми лунками обоих компонентов в течение 30-180 мин в зависимости от приложенного напряжения. Встречный иммуноэлектрофорез (ВИЭФ) предназаначен для обнаружения и индентификации преципитирующих систем АГ-АТ при условии, что антиген обладает электрофоретической подвижностью, отличной от той, которой обладают иммуноглобулины. ВИЭФ используют для индентификации антигенов вирусного гепатита В, антител к Aspergillus при бронхолегочном аспергилизе, антител к N.meningitidis, антител к ДНК при СКВ.
Методы, основанные на реакции агглютинации

Различают прямую и непрямую, или пассивную, агглютинацию.

В прямой агглютинации антигеном является сама микробная клетка или структурные компоненты ее поверхностной оболочки. Предел чувствительности реакции агглютинации микробов 0,01 мкг азота белка антител/мл.Количественные результаты реакции могут быть получены химическим определением содержания азота белка иммуноглобулинов.

Агглютинация определяется в большей степени особенностями клеточной оболочки и ее функциями, нежели свойствами агглютининов. Агглютинации способствует расположение антигенных рецепторов клеточной поверхности в виде скоплений. Если многовалентные агглютинины взаимодействуют одновременно с несколькими антигенными рецепторами, константа ассоциации Ка повышается по сравнению с Ка для случаев соединения антитела с антигеном единичной связью.

Ориентировочная реакция агглютинации. Ориентировочную РА проводят на предметных стеклах. Для этого на обезжиренное стекло наносят пастеровской пипеткой несколько капель сыворотки небольших (1:10-1:20) разведений и каплю изотонического раствора натрия хлорида для контроля. В каждую каплю сыворотки, а также в каплю контроля вносят петлю суточной живой культуры микроорганизма, взятой с поверхности плотной питательной среды, или пастеровской пипеткой вводят одну каплю взвеси убитых микроорганизмов (диагностикума). Внесенную культуру тщательно перемешивают, чтобы капля жидкости была равномерно мутной.
Реакция происходит при комнатной температуре. Результаты её учитывают невооруженным глазом через 5-10 минут, иногда для этого используют лупу (х5). Если предметные стекла поместить во влажную закрытую камеру, чтобы исключить испарение капель, то результаты реакции можно учитывать и через 30-40 минут. При положительной реакции в капле с сывороткой отмечают появление хлопьев (крупных или мелких), хорошо видимых при покачивании покровного стекла. При отрицательной – жидкость остается равномерно мутной.
В тех случаях, когда количество микроорганизмов невелико и учесть результаты реакции трудно, каплю сыворотки с внесенной в неё культурой высушивают, препарат фиксируют, окрашивают фуксином Пфейффера и микроскопируют. При положительной реакции всё поле зрения свободно от микроорганизмов, только в отдельных участках наблюдается их скопление. При отрицательной реакции микроорганизмы равномерно распределены по всему полю зрения. Эта реакция получила название микроагглютинации.

Развернутая реакция агглютинации используется для определения серогруппы, серовара микроорганизмов; проводят её по схеме, представленной в таблице. Все ингредиенты разливают по пробиркам в определенной последовательности. Сыворотку разводят 2-кратно – 1:100, 1:200, 1:400 и т.д.