биохимия. Значение изучаемой темы

• Название: Значение изучаемой темы
• Дата: 20.05.2018
• Размер: 1.04 Mb.
• Имя файла: биохимия.doc
• Тип: Документы; #44360
• страница: 2 из 10

Тема № 2. Ферменты. Биохимическая диагностика острого панкреатита: определение активности амилазы в сыворотке крови и моче.

Значение изучаемой темы: Ферменты являются основой всей биохимии, так как в организме человека ими катализируются практически все реакции. Многие заболевания являются результатом изменения активности ферментов или их полного отсутствия. Кроме того, используемые лекарства действуют путем влияния на активность ферментов. Поэтому знание данной темы является непременным условием успешного обучения не только по биохимии, но и по другим дисциплинам в дальнейшем.

1.1. Отличия ферментов от неорганических катализаторов. Активный центр ферментов

Ферменты – это биологические катализаторы белковой природы.

Простые ферменты состоят только из аминокислот, а сложные – из двух частей: белковой (апофермент) и небелковой (кофактор).

Если кофактор прочно связан с апоферментом, он называется простетической группой, если непрочно – коферментом.

В отличие от неорганических катализаторов, ферменты:

• 
  действуют в мягких условиях (t^о=37^оС, рН 7,4, давление 1атм);
  
• 
  специфичны, т.е. катализируют определенные реакции. При абсолютной специфичности действуют на один субстрат (S), а при относительной специфичности действуют на определенный тип связи. Специфичность фермента обусловлена его конформацией;
  
• 
  обладают высокой эффективностью;
  
• 
  регулируются, то есть при определенных условиях работают с соответствующими данной ситуации скоростями.
  

Участок фермента, в котором происходит специфическое связывание субстрата и его превращение в продукт, называется активным центром.

Активный центр простых ферментов состоит из аминокислот, у сложных ферментов, кроме аминокислот, в состав активного центра входит кофактор.

По теории Фишера субстрат подходит к ферменту, как ключ к замку, то есть между конформацией активного центра и конформацией субстрата существует абсолютное пространственное соответствие.

Согласно теории Кошланда, активный центр фермента формируется окончательно при взаимодействии его с субстратом, то есть субстрат меняет активный центр в соответствии со своей формой в момент контакта с ферментом.

1.2. Механизм действия ферментов

Скорость химической реакции определяется энергией активации (Э_акт) - чем меньше энергия активации, тем легче (скорее) протекает реакция.

В присутствии фермента (Е) реакция (S Р) делится на несколько стадий:

_{1 2}

S + E ES E + P
Вначале фермент взаимодействует с субстратом (S) с образованием фермент-субстратного комплекса (ЕS). Энергия этой стадии невелика, и комплекс образуется быстро.

На второй стадии происходит образование продукта (Р). Поскольку энергия ES-комплекса уже достаточно высока, то Э_акт2 второй стадии будет опять невелика и переходное состояние ES достигается быстро. Таким образом, в присутствии фермента реакция делится на несколько стадий, каждая из которых имеет низкую энергию активации и поэтому протекает быстро.

Этот механизм обеспечивается следующими факторами:

• 
  сближение и ориентация реакционного центра субстрата под каталитическую группу фермента;
  
• 
  напряжение и деформация, как субстрата, так и фермента, приводящие к увеличению энергии фермент-субстратного комплекса, что создает невыгодность его существования;
  
• 
  кислотно-основной или ковалентный катализ.
  

1.3. Свойства ферментов

Белковая природа ферментов определяет уникальные свойства этих катализаторов:

1. 
   Активность ферментов зависит от температуры. При низких температурах активность ферментов низкая из-за небольшой скорости движения молекул, при этом вероятность встречи фермента с субстратом мала. При повышении температуры активность фермента возрастает. Однако, многие ферменты при t^о=40^оС и более денатурируют, поэтому их активность снижается. Для большинства ферментов человека оптимальная температура 37-38^оС.
   
2. 
   Активность ферментов зависит от рН среды. Для каждого фермента существует такая область рН (оптимум), в которой он проявляет максимальную активность. В этой зоне рН конформация фермента максимально соответствует субстрату. При снижении или увеличении рН от оптимума разрушаются связи, построенные на кислотно-основных взаимодействиях (водородные, ионные). Это приводит к изменению конформации фермента, а, следовательно, и активного центра. В результате активность фермента снижается. Таким образом, ацидоз и алкалоз вызывают снижение активности ферментов и поэтому, опасны для жизни. Для большинства ферментов оптимум рН находится при рН =7,4.
   
3. 
   Скорость ферментативной реакции зависит от концентрации субстрата. При низких концентрациях субстрата вероятность столкновения с молекулой фермента мала и образование продукта будет происходить очень медленно. С увеличением концентрации субстрата вероятность столкновения возрастает, скорость реакции увеличивается. Когда все активные центры молекул фермента заполняются субстратом, скорость реакции становится постоянной (максимальной). Концентрация субстрата, при которой достигается максимальная скорость, называется насыщающей. Концентрация субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной, называется константой Михаэлиса (К_М). К_м характеризует сродство фермента к субстрату_, то есть способность фермента связывать субстрат. Чем меньше К_М, тем выше сродство.
   
4. 
   4. Зависимость скорости реакции от концентрации фермента.
   

При насыщающих концентрациях субстрата зависимость прямая.

1.4. Определение активности фермента

Активность ферментов определяют:

- по скорости убывания субстрата;

- по скорости образования продукта.

За единицу любого фермента принимают такое его количество, которое катализирует превращение 1 мкмоль вещества в 1 минуту.


мкмоль


У
мин х мг белка
дельная активность = ----------------------- .

1.5. Изоферменты

Это разновидности ферментов, катализирующие одну реакцию, но отличающиеся по своему составу и физико-химическим свойствам.

Изоферменты имеются у ферментов с четвертичной структурой. Изоферменты различаются по кинетическим параметрам (V_макс и К_М), тканевой локализации, электрофоретической подвижности, чувствительности к регуляторам и т.д.

В зависимости от возраста, физиологического состояния и других причин, в организме устанавливается определенное соотношение изофер-ментов, которому соответствует определенный уровень активности фермента в целом. Изменение их соотношения в отдельных тканях или органах является одним из способов регуляции метаболических процессов в организме.

Определение активности определенных изоферментов в сыворотке крови используется для диагностики.

1.6. Регуляция активности ферментов

Вещества, изменяющие активность ферментов, называются эффекторами или регуляторами. Эффекторы, снижающие активность ферментов, называются ингибиторами, повышающие активность – активаторами.

Механизмы изменения активности ферментов

1. 
   Аллостерический. Регулятор присоединяется к аллостерическому центру с помощью нековалентных связей.
   

Аллостерический центр – это участок фермента, пространственно не совпадающий с активным центром. Присоединение регулятора к аллостерическому центру приводит к изменению конформации фермента, а, следовательно, и активного центра. Сродство фермента при этом изменяется. Аллостерические регуляторы вызывают активацию или ингибирование фермента. Аллостерическими регуляторами являются метаболиты, макроэрги, коферменты, катионы металлов, цАМФ, субстраты.

2. 
   Химическая модификация. Заключается в изменении химической структуры фермента в результате ковалентного присоединения регулятора в любом месте фермента. Химическое изменение фермента вызывает изменение конформации, а, следовательно, активности. Химическая модификация может осуществляться путем:
   

• 
  фосфорилирования - дефосфорилирования;
  
• 
  метилирования - деметилирования;
  
• 
  аденилирования – деаденилирования и других.
  

Отщепление регулятора возвращает активность фермента в исходное состояние.

Частным случаем химической модификации является ограниченный протеолиз. Ограниченный протеолиз – это процесс отщепления какой-либо части фермента в виде олиго - или полипептида. В результате изменяется химическая структура фермента и формируется активный центр. Активность фермента возрастает.

3. 
   Взаимодействие "белок-белок". Этот механизм регуляции не является самостоятельным и характерен только для ферментов с четвертичной структурой, то есть состоящих из субъединиц. Диссоциация или ассоциация этих субъединиц приводит к изменению конформации активного центра. Для одних ферментов ассоциация приводит в активации фермента, а диссоциация – к ингибированию, для других наоборот. Изменение взаимодействия между субъединицами возникает в результате присоединения аллостерического регулятора или в результате химической модификации фермента.
   

Ингибирование ферментов

Ингибирование ферментов бывает обратимым и необратимым.

Необратимые ингибиторы прочно связываются с ферментами, при этом связываются или разрушаются функциональные группы, необходимые для проявления каталитической активности.

Необратимые ингибиторы не имеют физиологического значения и являются ферментными ядами.

Обратимыеингибиторы действуют недолго. Комплекс "фермент-ингибитор" непрочен и быстро диссоциирует, активность фермента при этом восстанавливается.

Обратимые ингибиторы делятся на конкурентные и неконкурентные.

Конкурентный ингибиторпохож на субстрат по структуре и форме, поэтому может конкурировать с ним за место в активном центре. Степень ингибирования зависит от концентрации субстрата и ингибитора. Чем больше концентрация ингибитора, тем сильнее ингибирование.

Неконкурентныеингибиторы структурно не похожи на субстрат, поэтому действуют вне активного центра путем аллостерического механизма или путем химической модификации.

1.7. Регуляция ферментативных цепей

Регуляция в ферментативных цепях направлена на ключевые ферменты, которые катализируют, как правило, необратимые реакции. К ключевым ферментам относятся:

а) фермент, стоящий в начале цепи;

б) лимитирующий фермент (имеет наименьшую скорость в цепи);

в) ферменты, стоящие на развилке цепи.

1.8. Классификация ферментов

1. 
   Оксидоредуктазы– катализируют окислительно-восстановительные реакции.
   
2. 
   Трансферазы– катализируют реакции переноса химических групп.
   
3. 
   Гидролазы – катализируют расщепление связей с внедрением воды по месту разрыва.
   
4. 
   Лиазы – катализируют расщепление связей без помощи воды с образованием или расщеплением двойных связей.
   
5. 
   Изомеразы– катализируют изомерные превращения.
   
6. 
   Лигазы (синтетазы) – катализируют реакции синтеза.
   

1.9. Использование ферментов в медицине

1. 
   Энзимопатология– изучает значение нарушений активности ферментов в развитии заболеваний.
   

Энзимодиагностика:

а) применение ферментов для определения различных веществ в биологических жидкостях;

б) измерение активности ферментов или изоферментов в крови и моче для диагностики болезней, сопровождающихся разрушением клеток.

2. 
   Энзимотерапия – использование ферментов в качестве лекарств. Энзимотерапия проводится:
   

а) при нарушении пищеварения;

б) для очистки гнойных ран (трипсин, химотрипсин);

в) для лечения вирусных заболеваний (ДНК-аза, РНК-аза);

г) при тромбозах и тромбоэмболиях (фибринолизин, стрепто-лиаза, стрептодеказа, урокиназа);

д) для рассасывания контрактур рубцов после ожогов и операций (гиалуронидаза).

Норма активности амилазы в сыворотке – 16-30 г/л в час

2. Определение активности - амилазы в моче
Норма активности амилазы в моче – 28-160 г/л в час

Диагностическое значение определения амилазы

Повышение активности амилазы (гиперамилаземия) наблюдается при остром панкреатите. В первые 12 – 24 часа активность амилазы в крови повышается в 10-40 раз, затем быстро снижается и приходит к норме на 2-6 сутки. При этом активность фермента повышается также в моче (в 10-40 раз) и остается высокой до 7 суток. Гиперамилаземия наблюдается также при остром аппендиците, перитоните, перфоративной язве желудка и двенадцати-перстной кишки.

Гипоамилаземия чаще всего свидетельствует о недостаточности экзокринной функции поджелудочной железы. Также встречается у больных гепатитами, циррозами, злокачественными опухолями с метастазами в печень, обширными ожогами кожи, сахарным диабетом, гипотиреозом, при интоксикациях.

Отношение активности амилазы в крови к активности амилазы в моче служит показателем функциональной полноценности почечного фильтра.

б) Ситуационные задачи

1. 
   Почему ацидоз и алкалоз опасны для жизни? Для ответа на этот вопрос вспомните: а) что такое белок; его структуры и связи, с помощью которых создаются эти структуры; б) Какие связи в белках зависят от кислотно-основных свойств среды?
   
2. 
   Известно, что высокие концентрации аммиака сдвигают рН в щелочную сторону. Как это отразится на энергетическом состоянии клетки?
   
3. 
   Для лечения длительно не заживающих ран используют мази, в состав которых входят трипсин (расщепляет белки), гиалуронидаза (разрушает гиалуроновую кислоту). На чем основан их лечебный эффект?
   
4. 
   Объясните, почему при отравлении солями ртути, свинца, кадмия рекомендуют выпить сырые яйца или молоко.
   
5. 
   Раствор, содержащий высокомолекулярные вещества различной природы (полисахариды, белки, нуклеиновые кислоты), проявляет ка­талитическую активность по отношению к какой-либо определенной ре­акции. Природа катализатора неизвестна, установлено, что он обла­дает следующими свойствами:
   

а) снижает энергию активации;

б) ускоряет прямую и обратную реакции;

в) обладает высокой специфичностью;

г) ускоряет момент движения равновесия, не сдвигая его;

д) прекращает каталитическое действие после добавления в раствор вещества, разрушающего пептидные связи.

Какое из этих свойств служит прямым доказательством белковой природы катализатора?

6. 
   Найдите сходство и различие между химической модификацией и аллостерической регуляцией активности ферментов.
   
7. 
   Существует связь между степенью повреждения клеток и последовательностью выхода в кровь ферментов из различных отделов клетки. Объясните, какие ферменты будут выделяться а) при воспалении и б) при некрозе.
   
8. 
   Выберите и составьте последовательность событий, происходящих при аллостерическом ингибировании фермента:
   

а) уменьшается скорость превращения субстрата в активном центре;

б) изменяется конформация фермента;

в) эффектор присоединяется в активном центре;

г) изменяется конформация аллостерического центра;

д) нарушается комплементарность активного центра субстрату;

е) эффектор присоединяется в аллостерическом центре;

ж) изменяется конформация активного центра.

9. 
   Объясните, почему лекарства вводятся в организм через определенные промежутки времени в необходимой дозе. Нерегулярность приема лекарств приводит к снижению их эффективности. Почему? На чем основано действие многих лекарств? Для ответа вспомните:
   

а) что такое ферменты?

б) механизмы ингибирования ферментов. Виды ингибирования. Какой из них можно использовать для лечения болезней?