методичка ТГМУ. Методическое пособие для студентов медицинского университета по гистологии и цитологии с основами
 Скачать 1.57 Mb.
|
|
ВЛАДИВОСТОКСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ ДЛЯ СТУДЕНТОВ МЕДИЦИНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА ПО ГИСТОЛОГИИ И ЦИТОЛОГИИ С ОСНОВАМИ ЭМБРИОЛОГИИ Владивосток 2003 2 ВЛАДИВОСТОКСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ ДЛЯ СТУДЕНТОВ МЕДИЦИНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА ПО ГИСТОЛОГИИ И ЦИТОЛОГИИ С ОСНОВАМИ ЭМБРИОЛОГИИ Под редакцией: д.м.н. П.А. Мотавкина к.б.н. И.В. Ковалевой Владивосток 2003 3 Предлагаемое методическое пособие написано в соответствии с действующей программой и новейшими данными по гистологии, цитологии и эмбриологии для студентов 1-2 курсов Владивостокского государственного медицинского университета Составители: к.м.н. Баранов В.Ф., к.б.н. Ковалева И.В., д.м.н. Ломакин А.В., д.м.н. Рева Г.В., к.м.н. Марчук О.В., к.м.н. Матвеева Н.Ю., к.б.н. Холоденко Г.М. Технический редактор: Котова Н.Д. Рецензенты: д.м.н. Красников Ю.А. д.м.н. Маркина Л.Д. Утверждено к печати цикловой методической комиссией кафедр медико- биологических дисциплин ВГМУ, протокол № 10 от 12.02.03. 4 Весенний семестр 5 МЕТОДИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА ЛАБОРАТОРНОГО ЗАНЯТИЯ № 1 ДЛЯ СТУДЕНТОВ ВГМУ, кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии ТЕМА: «ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА» Время: 3 часа Хронокарта: 1.Организационная часть с мотивацией темы - 5 мин 2.Программированный контроль - 10 мин 3.Опрос – беседа - 35 мин 4.Объяснение препаратов - 10 мин 5.Перерыв - 15 мин 6.Контроль за самостоятельной работой студентов. Помощь в работе с препаратами - 65 мин 7.Подведение итогов. Проверка альбомов - 10 мин Мотивационная характеристика темы: Развитие гистологии как науки и её дальнейший прогресс тесно связаны с совершенствованием методов исследования. Гистология располагает большим арсеналом средств для изучения биологических структур на всех уровнях их организации: клеточном, тканевом, органном. Методы исследования, применяемые гистологией необходимы врачу любого профиля для диагностики, лечения и профилактики заболеваний, познания причин, вызывающих болезни и осложнения их течения. Материалы темы «Гистологическая техника» способствуют активному формированию мировоззрения будущего врача. Взаимоотношения между структурой и функцией рассматриваются с позиции диалектического представления о единстве материи и её движения; нет структуры без функции и нет функции без структуры. Структура является материальным субстратом любой функции организма. Необходимо отметить, что прогресс современной гистологии в большей степени определяется тем, что она основывается на достижениях физики, химии, математики и кибернетики. Внедрение новейших методов исследования обуславливает бурное развитие биологических наук, в том числе гистологии, обеспечивает широкое внедрение гистологии в клинические дисциплины. Учебная цель Общая цель - Знать общие принципы микроскопических методов исследования. Уметь работать на световом микроскопе. Конкретная цель - 1.Знать принципы работы и овладеть навыками работы на световом микроскопе. 2.Знать принципы работы поляризационной микроскопии. 3. Знать принципы работы фазовоконтрастной микроскопии. 4.Знать принципы работы интерференционной микроскопии. 5.Знать принципы работы флуоресцентной микроскопии. 6.Знать принципы работы электронной микроскопии. 7.Иметь представление о гистологических и гистохимических методах исследования. 8.Иметь представление о количественном методе исследования. 6 Необходимый исходный уровень знаний Из других предметов и предшествующих тем: 1. Физические свойства световой, люминесцентной, интерференционной, электронной микроскопии. 2. Химические свойства кислотных и щелочных растворов. 3. Устройство световых микроскопов: «Биолам», «Эрудит», «МБР-1», «МБИ» ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ. 1. Назвать основные части светового микроскопа. 2. Что такое разрешающая способность микроскопа. 3. Правила работы с микроскопом. 4. Что такое тёмнопольная микроскопия и её применение при исследовании объектов. 5.Каковы возможности фазовоконтрастной и интерференционной микроскопии в изучении биологических объектов. 6. Люминесцентная микроскопия. Первичная и вторичная флуоресценция. 7.Принципы работы электронного микроскопа. Его разрешающая способность. 8. Гистологические и гистохимические методы исследования. 9. Количественные методы гистологического исследования. Рекомендации для работы на занятии. Задание 1. Овладеть правилами работы со световым микроскопом. Объект изучения - «Биолам», «Эрудит», «МБР-1». Программа действий - Научиться микроскопировать при малом и большом увеличении объектива. Ориентировочные основы действий - Прежде, чем начать работу с микроскопом, нужно установить его на рабочем месте так, чтобы он был обращен колонкой к наблюдателю, а зеркалом к источнику света. Затем установить освещение при слабом увеличении объектива, повернув зеркало так, чтобы поле зрения микроскопа было освещено равномерно и достаточно ярко, но чтобы свет не раздражал глаз. После этого положить препарат на предметный столик покровным стеклом кверху, чтобы объектив приходился против отверстия столика. Микроскопирование препарата всегда надо начинать при слабом увеличении, глядя сбоку на микроскоп, нужно опустить его тубус, вращая от себя макровинт до тех пор, пока фронтальная линия объектива не будет на расстоянии 0,5 см от покровного стекла. Затем, смотрят в окуляр левым глазом и, держа при этом правый глаз открытым, медленно вращать макровинт на себя до получения изображения препарата. Для более четкой наводки пользуются микровинтом, вращая его не более, чем на пол-оборота в обоих направлениях. С помощью микровинта можно определить толщину препарата в мкм. Изучая препарат при слабом увеличении микроскопа, нельзя ограничиваться одним полем зрения - необходимо исследовать препарат по всей его поверхности, т.к. заключенный под покровное стекло гистологический 7 срез может лежать не совсем горизонтально, и толщина его частей может быть разной, при его перемещении теряется четкость изображения. Поэтому нужно, передвигая препарат держать свободную руку на макровинте и слегка вращать его. Но при этом нужно помнить, что микроскоп дает обратное изображение, т.е. при перемещении препарата сверху вниз изображение будет двигаться снизу вверх. После того, как найдено на препарате хорошее место дальнейшего изучения, необходимо поставить его в центре поля зрения и закрепить препарат зажимами. После этого сменить увеличение на сильное: поднять тубус микроскопа при помощи поворота микровинта на себя, сменить объектив слабого на объектив сильного увеличения поворотом револьвера. Глядя сбоку на микроскоп, вращают микровинт от себя до тех пор, пока фронтальная линза не приблизиться вплотную к покровному стеклу. После этого, глядя в окуляр, осторожно вращать микровинт на себя до появления четкого изображения препарата. Наиболее четкая наводка на фокус достигается вращением микровинта так же, как и при слабом увеличении. После окончания микроскопирования нельзя сразу снимать препарат с предметного стекла, нужно предварительно поднять тубус несколькими оборотами макровинта, иначе можно повредить препаратом фронтальную линзу. Затем приводят микроскоп в исходное состояние, т.е. ставят над отверстием столика объектив слабого увеличения на расстоянии 2-3 см. от него. Перенося микроскоп, держат правой рукой колонку штатива, а левую подставляют под его основание. С помощью оптических микроскопов можно изучать биологические объекты при различном увеличении. Увеличение до 440 х дают "сухие" объекты, т.е. те, при работе с которыми между препаратом и объективом имеется небольшое пространство (воздух), большое увеличение достигается с помощью короткофокусных объективов, когда между объективом и исследуемым препаратом помещают каплю жидкости (вода, масло). Эта система называется иммерсионной. В зависимости от применяемой жидкости различают масляную или водную иммерсию. Иммерсионная система позволяет изучать препараты с увеличением в 1200-1500 раз. Оптические микроскопы обладают ограниченными данными, в связи с чем, в гистологию введены новые методы микроскопии. Задание 2. Знать принципы работы поляризационного, интерференционного, люминесцентного, электронного микроскопов. Объект изучения - Поляризационный, интерференционный, люминесцентный, электронный микроскопы. Ориентировочные основы действий - Поляризационная микроскопия употребляется в цитологии для определенных целей. Она позволяет выявить структуры с упорядоченным расположением молекул (например, кристаллы или фибриллярные белки). Такие структуры обладают, как известно, двойным лучепреломлением (анизотропией): проходящий через них световой луч разделяется на два, распространяющихся с различной скоростью и в различных направлениях. В поле зрения поляризационного микроскопа анизотропные объекты оказываются ярко светящимися на темном поле. Отечественный 8 микроскоп МИН-8 является отличным прибором и вполне удовлетворяет исследователей-биологов. На кафедре имеется микроскоп "Варшава". Интерференционная микроскопия тоже основана на применении поляризационного света. На основе эффекта фазового сдвига можно судить о структурах объекта и плотности отдельных участков: т.к. сдвиг связан с плотностью структуры, то измерив величину клетки (или её части), можно найти её сухой вес в граммах. Флуоресцентная микроскопия позволяет изучать как собственную (первичную) флуоресценцию ряда веществ, так и вторичную флуоресценцию, вызывая окрашиванием биологических структур специальными красителями - флуорохромами. Принцип метода состоит в том, что некоторые вещества при световом облучении сами начинают светиться, причём длина волны испускаемого ими света всегда больше, чем длина волны света, возбуждающего флуоресценцию. Поэтому для возбуждения флуоресценции в видимой части спектра обычно пользуются синими или ультрафиолетовыми лучами. Собственной флуоресценцией обладают нуклеиновые кислоты, рибофлавин и ряд др. В качестве флуорохрома чаще всего применяют акридиновый оранжевый. Флуоресценцию можно наблюдать визуально и фотографировать. Всеми необходимыми качествами для произведения флуоресцентной микроскопии обладает наш отечественный микроскоп МЛ-2. Электронная микроскопия. Создание электронного микроскопа основано на возможности магнитного поля, обладающего магнитной симметрией подобно линзам, фокусировать поток электронов (Буш, 1926). В связи с тем, что длина волны электромагнитного колебания при движении электронов (=0.0056) короче длинны волны видимого света (200-800 нм), раз- решающая сила электронного микроскопа во много раз больше, чем у световых микроскопов. Полностью реализовать возможности электронного луча невозможно в связи с техническими затруднениями, однако уже сейчас разрешающая способность электронного микроскопа равна 1/2 -1/4 нм. Отечественные электронные микроскопы ЭММА-10 К имеют разрешающую способность 0,5 нм, а ЭНМ-100 Л-0,25 нм. Электронный микроскоп построен следующим образом: 1. Источник электронов (по типу электронной пушки). 2.Система электромагнитных конденсоров. 3.Держатель образца (исследуемого объекта). 4.Электронный объектив (система электромагнитов). 5.Система электронных проекторов. 6.Флуоресцентный экран для визуального наблюдения. 7. Камера для фоторегистрации изображения. Вся система элек- тронного микроскопа работает в глубоком вакууме. В отличие от светового микроскопа, в котором изображение определяется в связи с поглощением света в электронном микроскопе флуоресценции экрана и воспроизведение деталей объекта зависят от степени рассеивания электронов при прохождении через изучаемый объект. Препараты для электронного микроскопа должны быть тонкими (0,5-2,0 нм). Готовятся они на специальном ультратоме. В частности на кафедре имеется УМВБ-2. 9 Основная и дополнительная литература Основная литература: 1)Учебник гистологии (под ред. Ю.И. Афанасьева, Н.А. Юриной). М. , «Медицина», 1999. 2) Учебник гистологии (под ред. Ю.И. Афанасьева, Н.А. Юриной). М. , «Медицина», 1989. 3) Г.Э. Улумбеков «Гистология», 1999. 4) З.С. Канцельсон, И. Д. Рихтер «Практикум по гистологии цитологии и эмбриологии» 1963. 5) Ю.С.Ченцов «Общая цитология», 1978. 6) Г.А. Меркулов «Курс патогистологической техники», 1969. 7) Лекционный курс. Дополнительная литература: 1) М. Уикли «Электронныя микроскопия для начинающих», 1978, М. «Мир». 2) Н.Луппа «Гистохимия», 1979, «Мир». ТСО и наглядные пособия 1. Микроскопы 2. Внеаудиторные стенды: 1. Микроскопическая техника. 2. Жизнь кафедры. Домашнее задание: см. методическую разработку лабораторных занятий для студентов по теме: «Приготовление постоянного гистологического препарата». МЕТОДИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА ЛАБОРАТОРНОГО ЗАНЯТИЯ № 2 ДЛЯ СТУДЕНТОВ ВГМУ, кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии ТЕМА: «ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПОСТОЯННОГО ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА» Время: 3 часа Хронокарта: 1.Организационная часть с мотивацией темы - 5 мин 2.Программированный контроль - 10 мин 3.Опрос – беседа - 35 мин 4.Объяснение препаратов - 10 мин 5.Перерыв - 15 мин 6.Контроль за самостоятельной работой студентов. Помощь в работе с препаратами - 65 мин 7.Подведение итогов. Проверка альбомов - 10 мин Мотивационная характеристика темы: Развитие гистологии как науки и её дальнейший прогресс тесно связаны с совершенствованием методов исследования. Гистология располагает большим арсеналом средств для изучения биологических структур на всех уровнях их организации: клеточном, тканевом, органном. Методы исследования, применяемые гистологией 10 необходимы врачу любого профиля для диагностики, лечения и профилактики заболеваний, познания причин, вызывающих болезни и осложнения их течения. Материалы темы «Гистологическая техника» способствуют активному формированию мировоззрения будущего врача. Взаимоотношения между структурой и функцией рассматривается с позиции диалектического представления о единстве материи и её движения; нет структуры без функции и нет функции без структуры. Структура является материальным субстратом любой функции организма. Необходимо отметить, что прогресс современной гистологии в большей степени определяется тем, что она основывается на достижениях физики, химии, математики и кибернетики. Внедрение новейших методов исследования обусловило бурное развитие биологических наук, в том числе гистологии, обеспечивает широкое внедрение гистологии в клинические дисциплины. Учебная цель Общая цель - Знать содержание предмета и общебиологические основы гистологии. Уметь приготовить постоянный гистологический препарат Конкретная цель - 1. Знать цели и задачи гистологии, цитологии и эмбриологии. 2. Иметь представление о вкладе отечественных учёных в развитие гистологии. 3. Современное представление о клеточной теории. 4. Знать основные этапы приготовления постоянного гистологического препарата. Необходимый исходный уровень знаний Из других предметов и предшествующих тем: 1. Свойства химических веществ. 2. Правила работы со световым микроскопом. 3. Правила работы с кислотами и щелочами. Из темы текущего занятия: 1. Предмет и задачи гистологии. 2. Клеточная теория. 3. Методика окраски гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ 1. Гистология и её задачи. 2. Эмбриология и её задачи. 3. Цитология и её задачи. 4. Первые микроскописты. 5. Появление микроскопа в России. 6. Клеточная теория и её современная трактовка. 7. Основные этапы приготовления постоянного гистологического препарата. Рекомендации для работы на занятии. 11 Задание 1. Изучить этапы приготовления постоянного гистологического препарата. Программа действий - Постоянный гистологический препарат - это изготов- ленный из тканей и органов объект, позволяющий узнать их структуру с помощью микроскопирования. Он может представлять собой тонкий срез органов, тотальный препарат (мягкая мозговая оболочка, рыхлая соединительная ткань), мазок (красный костный мозг, кровь и пунктат органа), отпечаток органов (печень, селезёнка). Обработка объектов для приготовления из него постоянного гистологического препарата включает следующие моменты: (1) Взятие материала, (2) фиксирование, (3) обезвоживание и уплотнение, (4) заливка в плотные среды, (5) изготовление срезов, (6) окрашивание, (7) просветление и заключение в среду, служащую для сохра- нения препаратов. Взятие материала: объекты, подлежащие исследованию, забираются как можно раньше после забоя животного и сразу же фиксируются или за- мораживаются для сохранения структуры органов. В некоторых случаях пользуются иссечением тканей из живого организма (биопсия) с целью диагностического морфологического исследования. Иссечение кусочков проводится острым инструментом (бритвы, секционные ножи) во избежание повреждения тканей. Ножницами пользуются при иссечении оболочек (сальник, мягкая мозговая оболочка) и тонкостенных полых органов (желчный пузырь, кишечник). Кусочки из костей выпиливают, иссекают с учетом микроскопического строения того или иного органа или тканей величиной 1-1,5 см 3 ; например почки и надпочечник вырезают с таким расчетом, чтобы в них попали корковое и мозговое вещество, для чего разрезы ведут перпендикулярно поверхности органов. Из органов, имеющих во всех частях одинаковое строение (печень, селезёнка) объекты можно иссекать в любом участке, но желательно с капсулой. Кусочки из патологически изменённых тканей (опухоли, язвы) вырезают на границе с нормальными тканями так, чтобы были захвачены и нормальные, и изменённые участки. Фиксация. Цель фиксации - закрепление и сохранение тканевых структур в том виде, в котором они находились в момент забора материала. Это достигается коагуляцией белков фиксирующими жидкостями, которые должны достаточно быстро проникать в ткани и действовать "мягко", не вызывая грубых нарушений тканевых структур (например сморщивание, чрезмерное уплотнение). К фиксирующим жидкостям относят формалин, спирт, слабые растворы уксусной, азотной, хромовой и др. кислот, сулему, двухромовокислый калий. Фиксаторы, состоящие из какого - либо одного вещества называются простыми фиксаторами. Чаще применяются сложные фиксаторы, состоящие из смеси нескольких простых фиксирующих компонентов. Так, например, раствор Буэна включает уксусную, пикриновую кислоты и формалин, жидкость Ценкера состоит из двухромовокислого калия и сулемы, а жидкость Мюллера - это смесь двухромовокислого калия, сульфата натрия в воде. Выбор фиксатора зависит от характера объекта и цели, которая ставится при изготовлении препарата. Например, чтобы сохранить в клетках включения жира, следует 12 применять формалин, а не спирт, т.к. он является растворителем жира. В то же время этиловый спирт - наилучший фиксатор при исследовании в клетках железа, гликогена и нуклеиновых кислот. После фиксации кусочки промывают водой, если фиксатор содержит вещество, мешающее дальнейшей обработке (сулема, формалин). Если таких веществ нет (спирт или смеси, содержащие спирт), то кусочки не промываются. Обезвоживание. Уплотнение. Обезвоживание исследуемого образца производят в спиртах возрастающей концентрации (50 °, 60 °, 70 °, 80 °, 90 °, 100°) с целью уплотнения ткани и подготовки ее к пропитыванию целлоидином или парафином. В каждом спирте исследуемый образец выдерживают не менее суток. Заливка. Для того чтобы из кусочка можно было приготовить срез, необходимо придать ему еще более плотную консистенцию. Для этих целей применяются парафин и целлоидин. Принцип заливки заключается в последовательном проведении кусочка через ряд жидкостей, из которых каждая предыдущая должна обладать способностью смешиваться с последующей. Схема заливки в парафин состоит в следующем: 1.Спирт 100° - 1-2 часа; 2. Смесь 100° спирта и ксилола 1:1 - до погружения кусочка; З.Ксиол (хлороформ) 1час; 4.Раствор парафина в ксилоле - 0,5-1 час; 5.Расплавленный парафин (воск) 1-2 часа. Время каждого этапа заливки вместе с тем определяется особенностями объекта. После пребывания в расплавленном па- рафине в термостате при температуре 37°С -1-2 часа или при 56°С 0,5-1 час, образец полностью пропитывается парафином. В целях полного освобождения объекта от ксилола кусочки проводят последовательно через 2-5 порций расплавленного парафина. Затем кусочек вместе с расплавленным парафином помещают в формочку, где он застывает при комнатной температуре в плотный блок. Схема заливки в целлоидин состоит в последовательной проводке материала в 100° спирте, смеси спирта и эфира, 5% целлоидине. В каждом растворе целлоидина образец выдерживают от 3 до 7 дней, после чего кусочек вследствие испарения спирта и эфира застывает в плотный гель. Это позволяет нарезать исследуемый образец с прилежащим целлоидином и наклеить его на деревянный брусок. Таким образом, парафиновые блоки могут сохраняться длительное время, а целлоидиновые помещают в 70° спирт для сохранения. Наряду с названными уплотняющими средствами, в настоящее время применяют синтетические смолы и полимеры (например, поливакс, карбовакс или полиэтиленгликоль). Изготовление срезов. Из залитых целлоидиновых и парафиновых блоков готовят срезы необходимой толщины (5-10мкм) на специальных приборах различной конструкции - микротомах. Наиболее распространённым является санный микротом (МС-2), в котором нож и объектодержатель движутся на специальных салазках. Основные части микротома: 1.Станина - массивная чугунная основа, на которую монтируются все остальные узлы. 2. Механизм подъема. 3. Зажим для блока. 4. Ножевые салазки, несущие на себе ножедержатель. Последний укрепляется на салазках рукояткой, позволяющей 13 менять горизонтальный угол расположения ножа. Зажим снабжен подвижной цилиндрической втулкой, перемещение которой с помощью винта меняет угол наклона ножа. 5. Механизм микропередачи состоит из стержня соединённого с тягой храповика микровинта. Эта система поднимает столик с объективом на высоту, соответствующую толщине среза, а движущийся в горизонтальной плоскости нож режет блок. При необходимости получения препарата в короткий срок (например, с диагностической целью) используется замора- живающий микротом или криостат. Первый построен по санному принципу, но имеет особенности конструкции и монтажа. Основные его узлы: станина, механизм подъёма, бритводержатель и замораживающий столик. Криостат, в свою очередь, представляет собой холодильник, в рабочей камере которого установлен микротом. Сравнительно небольшой объём камеры, надежная теплоизоляция, наличие специального регулирующего механизма, позволяют поддерживать постоянно заданную минусовую температуру. Таким образом, уплотнение материала при резке на замораживающем микротоме и криостате достигается замораживанием образца. Окрашивание. С тех пор, как было установлено, что отдельные составные части клеток, и межклеточные элементы по-разному воспринимают и удерживают красители, было предложено большое количество окрасок препаратов. Хотя до настоящего времени полностью не выяснена сущность механизмов действия многих красителей, несомненно, что в основе окрашивания микроструктур лежат физико-химические процессы. Из физических факторов следует отметить диффузию, адсорбцию (поверхностное впитывание) красителя, а также его растворимость, из химических - электролитические свойства красящих веществ в самих тканях. Немаловажное значение имеет плотность тканей и дисперсность самого красителя. Первое свойство определяет последовательность окраски отдельных структур, второе - скорость процесса окраски. На электролитических свойствах основано разделение применяемых в гистологической практике красителей на три группы: основные, кислые и нейтральные. Основной краситель представляет собой красящее основание или его соль и окрашивает клеточные и тканевые структура кислой природы (например: хроматин, ядра, содержащие ДНК, ядрышко, содержащие РНК). Отсюда и термин - базофилия (любящий основание) для обозначения тканевых компонентов, окрашивающихся красителями, таким как тионин, гематоксилин, метиловый зелёный, кармин, азур, сафранин и др. Кислотный краситель - это красящая кислота и её соль, в силу чего она окрашивает вещества и частицы основной природы, например гранулы эозинофильных лейкоцитов, цитоплазму большинства клеток. Отсюда оксифилен для тканевых элементов, красящихся кислотными красителями, к которым относятся эозин, кислый фуксин, конго красный, анилиновый синий и др. Нейтральный краситель образуется при соединении водных растворов кислотного и основного красителя, например судан - 3, эозиновокислый ме- тиленовый синий. Кроме того, в гистологической практике часто используются специальные красители. Так, например, для выявления жира применяется судан - 3 и шарлах красный. Первый окрашивает жир в желтый, а второй - в 14 оранжевый цвет. Осмиевая кислота окрашивает жиры в черный цвет. Эластические волокна при обработке орсеином окрашиваются в коричневый цвет, резорцин фуксином в темносиний цвет, а пикрофуксин окрашивает их в желтый цвет. Для выявления нервных элементов, клеточных границ и органоидов в различных тканях применяется импрегнация (пропитывание) раствором азотистокислого серебра, осмиевой кислоты, хлорного золота, основанная на восстановлении свободных металлов и осаждении их на исследуемых структурах. Просветление и заключение. Сохранение прозрачности, окраска и структурная целостность постоянного гистологического препарата обеспечивается просветлением и заключением препарата в специальные среды. Средой для заключения служат смола канадской основы (канадский бальзам) и пихтовая смола, употребляющиеся в виде густых растворов этих смол в ксилоле. Применение их при предварительном обезвоживании абсолютным спиртом и просветлении ксилолом. При отсутствии смол можно пользоваться дамарным лаком (60% раствор смолы деревьев рода произрастающих в Индии) или раствором канифоли в спирте, который получают из различных видов сосны. В тех случаях, когда по условиям обработки препарат не может соприкасаться со спиртом, ксилолом и т.п. (например окраски на жиры) его заключают в среду (глицерин, глицерин-желатин), которые, кроме того, обладают просветляющими свойствами. Например, широко распро- страненными методами окраски препаратов является окраска гематоксилин- эозином и по Ван-Гизону. Особенности методики приготовления постоянных гистологических препаратов некоторых органов и тканей: I.Обработка и окрашивание костной ткани. Наличие в межклеточном веществе костной ткани солей кальция придаёт ей твёрдость, затрудняющую приготовление препаратов. Поэтому обработка костной ткани включает приготовление срезов после специальной предварительной подготовки объекта - декальцинацией в водном растворе азотной кислоты 5-7% концентрации, кроме того, одним из способов получения препаратов из костной ткани яв- ляется приготовление тонких костных пластинок (шлифов) из клубочков нефиксированной костной ткани путём стачивания последних. Наиболее распространенным методом окраски срезов декальценированой кости является окраска по Шморлю (тионином с пикриновой кислотой), после чего общий фон срезов приобретает коричневый или болотный цвет, а костные клетки и их отростки окрашиваются в красный. II.Приготовление тотальных препаратов. В тех случаях, когда необходимо изучить микроскопическую структуру объекта, имеющего пленочное строение (серозные, мозговые оболочки), готовят целостные тотальные препараты. Для этого участок пленки во избежание складок расправляют и фиксируют на ровной поверхности. По окончании фиксации материал обрабатывают обычным способом или, если объект сам по себе достаточно тонок и имеет естественную окраску, то можно ограничиться лишь фиксацией, просветлением и заключением его (например, при выявлении пигментных клеток твёрдой и 15 мягкой мозговых оболочек) или фиксацией, окрашиванием (препарат мелких сосудов мягкой мозговой оболочки). III. Приготовление и окраска мазков крови. Для морфологического иссле- дования клеток крови и подсчета лейкоцитарной формулы готовят мазок крови. Он должен отвечать следующим условиям: 1.Начинаться на расстоянии 1 см от края предметного стекла и заканчиваться, не доходя до края противоположной стороны на 2-3 см. 2. Препарат должен быть равномерной толщины, а не волнообразным. 3. Слой крови не должен достигать краев стекла. В противном случае в мазке эритроциты будут лежать густым слоем, и образовывать монетные столбики, фиксируют метиловым (этиловым) 100° спиртом и окрашивают по методу Романовского - Гимза (азур-2 с эозином). Первый окрашивает базофильные структуры клеток в ярко-синий цвет, а эозин- оксифильные части в розово-красный. IV. Гистологические препараты для пунктатов органов. Диагностическая пункция (взятия материала с помощью специальных игл) всё больше входят в гистологическую практику. Гистологические препараты из пунктата обладают преимуществом перед мазками, поскольку они позволяют изучить структуру нормальной и патологически измененной ткани. Пунктат смешивают в чашке Петри с раствором лимоннокислого натрия для предупреждения свёртывания крови. После кратковременного стояния жидкое содержимое сливают, а осевшие плавающие частички собирают на полоску фильтровальной бумаги. Эту процедуру проводят несколько раз. Собранный материал вместе с фильтровальной бумагой фиксируют в зависимости от взятого органа (например, печень в 10% формалине, костный мозг в жидкости Ценкера) и по окончании фиксации - промывка в проточной воде, проводят через спирты и заключают в парафин, предварительно отделив фильтровальную бумагу. Окраска производится в зависимости от цели исследования. Задание 2. Окрасить целлоидиновые срезы методом гематоксилин- эозином. Объект изучения - Целлоидиновые срезы органов. Ориентировочные основы действий - 1. Срезы из дестиллированной воды переносят в раствор гематоксилина на 2-5 мин. Затем срезы помещают в проточную воду на 10 мин. Затем их переносят в дестиллированную воду, а затем - в раствор пикрофуксина на 3-5 мин и быстро споласкивают дестиллированной водой. Проводят через 96° спирт (быстро). Просветляют в скипидаре, карбол-ксилоле в течение 2-Змин. Заключаем в бальзам, затем покрывают стеклом. Задание 3. Окрасить целлоидиновые срезы методом по Ван-Гизону. Объект изучения - Целлоидиновые срезы органов. Ориентировочные основы действий - Срезы из дестиллированной воды переносят в раствор гематоксилина на 2-5 мин. Затем срезы помещают в проточную воду на 10 мин. Затем срезы переносят из проточной воды в дестиллированную воду, а затем - в раствор пикрофуксина на 3-5 мин. Быстро 16 споласкивают дестиллированной водой. Проводят через 96° спирт (быстро). Просветляют в скипидаре, карбол-ксиоле в течение 2-Змин. Заключают в бальзам, затем покрывают стеклом. Вопросы для самоконтроля 1. Какими методами окраски можно пользоваться для выявления жировых включений? 2.Какими методами окраски можно пользоваться для выявления эластических структур? 3. Какими методами окраски можно пользоваться для выявления гликогена? 4. Какой метод исследования можно применять для выяснения источников и путей иннервации органов? 5.Каким методом микрокопирования необходимо воспользоваться для определения сухого веса клетки? Основная и дополнительная литература Основная литература: 1)Учебник гистологии (под ред. Ю.Л. Афанасьева, Н.А. Юриной). М. , «Медицина», 1999. 2) Учебник гистологии (под ред. Ю.И. Афанасьева, Н.А. Юриной). М. , «Медицина», 1989. 3) Г.Э. Улумбеков «Гистология», 1997. 4) З.С. Канцельсон, И. Д. Рихтер «Практикум по гистологии цитологии и эмбриологии» 1963. 5) Ю.С.Ченцов «Общая цитология» , 1978. 6) Г. А. Меркулов «Курс патогистологической техники», 1969. 7) Лекционный курс. Дополнительная литература: 1) М. Уикли «Электронная микроскопия для начинающих», 1978, М. "Мир". 2) Н.Луппа «Гистохимия», 1979, «Мир». ТСО и средства наглядности 1. Микроскопы 2. Диапроектор «Альфа» 3. Слайды. 1. Эндотелий капилляров (импрегнация азотнокислым серебром). 2. Гликоген в атипичных мышцах сердца (ШИК - реакция). 3. Артерии эластического типа (Орсеин). 4. Извитые канальцы почки (гематокселин - эозином) 5. Атипичные мыщечные клетки стенки сердца (Маллори). 6. Холинергические нервные волокна сосудов головного мозга (окраска с глиоксиловой кислотой). 4. Демонстрационные препараты: 1.Матка (метод щелочная фосфатаза). 2. Матка ( метод магниевая АТФ- аза). 3.Матка (метод бутирилхолинэстераза). 4.Матка (наливка сосудов тущью). 5. Почка (метод щелочная фосфатаза). 6. Почка (гематоксилин - эозином) Домашнее задание - см. методическую разработку лабораторных занятий для студентов по теме:«Формы организации живой материи. Цитоплазма и ядро клетки». 17 МЕТОДИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА ЛАБОРАТОРНОГО ЗАНЯТИЯ № 3 ДЛЯ СТУДЕНТОВ ВГМУ, кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии |