Вирусология. вирус экзамен. Рекомбинация вирусов
 Скачать 0.68 Mb.
|
|
1. Рекомбинация вирусов- обмен генетическим материалом между двумя близкими, но отличающимися по наследственным свойствам вирусам. Рекомбинация — обмен генетическим материалом между вирусами — возможна в виде обмена генами (межгенная рекомбинация) или участками одного и того же гена (внутригенная рекомбинация). У вирусов рекомбинация происходит в процессе заражения двумя или более типами вирусов, отличающимися друг от друга по генетическим признакам. Вариантом рекомбинации является перекрестная реактивация, или кросс-реактивация, происходящая в том случае, когда у одного из штаммов вируса часть генома повреждена, а другой геном нормальный. При смешанной инфекции двумя такими вирусами в результате рекомбинации появляются штаммы вируса со свойствами родительских микроорганизмов.Рекомбинации могут быть:межгенные – обмен полными генами, внутригенная – обмен участками генов. Образующися рекомбинантный вирус преобретает свойства обоих вирусов. В экспериментальных условиях гибридные (рекомбинантные) формы можно получить при совместном введении в клетку: 1) двух жизнеспособных вирусов ; 2) живого и инактивированного вируса 3) живого вируса и вирусной нуклеиновой кислоты , выделенной из другого штамма; 4) одновременно двух нуклеиновых кислот от разных вирусов. 2. Получение первично трипсинизированных культур клеток. ПТКК – клетки, полученные непосредственно из органов или тканей организма, растущие in vitro в один слой. КК можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного. Лучше это удается сделать из эмбриональных органов, т.к. клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для получения их используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы. Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2-3 часов после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают, обрабатывают трипсином, панкреатином, коллагеназой. Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37С. Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делится. На стекле формируется слой толщиной в одну клетку, обычно через 3-5 дней. Питательную среду меняют по мере загрязнения ее продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохранят жизнеспособность в течение 7-21 дня. При культивировании вирусов в КК удается получать препараты с высоким титром вируса, что важно при получении АГ и вакцин. С помощью метода КК были решены некоторые теоретические вопросы – о взаимодействии вируса с клеткой, месте репродукции вирусов, механизме антивирусной иммунизации. В настоящее время КК применяют для выделения вирусов из патматериала, их индикации, идентификации, для постановки реакции нейтрализации, определения титра вирусов, для приготовления диагностических АГ и вакцин, в качестве тест – объектов в реакции нейтрализации. 3. Проведение биопробы на развивающихся эмбрионах птиц. .Подготовка куриных эмбрионов к заражению Эмбрионы доставляют из инкубатория, не допуская их охлаждения в пути. В лаборатории эмбрионы инкубируют в термостате при температуре 37° С и влажности 60-70 %, что достигается установлением в термостате открытых широкогорлых сосудов с водой. Вентиляционные отверстия термостата должны быть открыты. Эмбрионы размещают воздушной камерой вверх в специальных штативах. Подготовка куриных эмбрионов к заражению включает овоскопирование и дезинфекцию скорлупы, а также соответствующую подготовку рабочего места. Овоскопирование представляет собой просмотр яиц против достаточно яркого источника света (овоскоп), в результате чего на неосвещенной стороне скорлупы образуются тени от внутренних структур. Овоскопирование проводят в затемненном помещении. При этом на скорлупе графитным карандашом отмечают границу воздушной камеры, место расположения зародыша и участок бессосудистой зоны размером 0,5x0,5 см. Эти отметки служат ориентиром при выборе места введения вируссодержащего материала. При овоскопировании также определяют, жив зародыш или погиб. В предбокснике скорлупу эмбрионов обрабатывают йодированным спиртом, затем уже в боксе повторно протирают, а иногда еще и фламбируют – обрабатывают пламенем смоченного спиртом тампона. Эмбрионы фиксируют в специальных подставках, установленных в эмалированной кювете на 3-4-слойной марлевой салфетке, смоченной дезинфицирующим раствором. В работе используют инструменты, стерилизованные кипячением. Их ставят в баночку со спиртом и обжигают пламенем горелки перед каждым повторным использованием. 1. Заражение в аллантоисную полость 2. Заражение на хорионаллантоисную оболочку. 3. Заражение в желточный мешок. 4. Заражение в амниотическую полость. 5. в тело зародыша. 6. Заражение в кровеносные сосуды ХАО Показателем заражения эмбриона вирусом может служить его гибель в характерные для данного вируса сроки. Другой признак размножения вируса – патологоанатомические изменения, появляющиеся в различных структурах эмбриона. Так, ХАО может быть отечной, иметь кровоизлияния, узелки, или, как их называют, оспины. Сам зародыш может отставать в росте и развитии от незараженных, т. е. проявлять феномен карликовости. Тело его может быть в разной степени обезвожено или мумифицировано, шея характерно перекручена. Кожа зародыша может быть гиперемирована, с кровоизлияниями. Внутренние органы также могут иметь признаки размножения вируса. 4. Классификация вирусов, что положено в ее основу? Современная классификация вирусов универсальна для вирусов позвоночных, беспозвоночных, растений и простейших. Она основана на фундаментальных свойствах вирионов, из которых ведущими являются признаки характеризующие нуклеиновую кислоту, морфологию, стратегию генома, АГ свойства. Фундаментальные свойства поставлены на 1 место, поскольку вирусы со сходными АГ свойствами обладают и сходным типом нуклеиновой кислоты, сходными морфологическими и биофизическими свойствами. Важным признаком для классификации, который учитывается нарду со структурными признаками, является стратегия вирусного генома, под которой понимают используемый вирусом способ репродукции, обусловленный особенностями его генетического материала. АГ и другие биологические свойства являются признаками, лежащими в основе формирования вида и имеющими значение в пределах рода. В основу современной классификации положены следующие основные критерии: 1) тип нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК), ее структура (количество нитей); 2) наличие липопротеидной оболочки; 3) стратегия вирусного генома; 4) размер и морфология вириона, тип симметрии, число капсомеров; 5)феномены генетических взаимодействий; 6) круг восприимчивых хозяев; 7) патогенность, в том числе патологические изменения в клетках и образование внутриклеточных включений; 8) географическое распространение; 9) способ передачи; 10) АГ свойства. На основании перечисленных признаков вирусы делятся на семейства, подсемейства, роды и типы. Для упорядочения наименований вирусов выработан ряд правил. Название семейств оканчивается на «viridae» «virinae» «virus». В названии допускаются привычные латинизированные обозначения, цифры и обозначения типов, сокращения, буквы и их сочетания. Классификация и таксономия вирусов. Вирусы составляют царство Vira, которое подразделено по типу нуклеиновой кислоты на два подцарства — рибовирусы и дезоксирибовирусы. Подцарства делятся на семейства, которые в свою очередьподразделяются на роды. Понятие о виде вирусов пока еще четко не сформулировано, так же как и обозначение разных видов. В качестве таксономических характеристик первостепенное значение придается типу нуклеиновой кислоты и ее молекулярно-биологическим признакам: двунитевая, однонитевая, сегментированная, несегментированная, с повторяющимися и инвертированными последовательностями и др. Однако в практической работе прежде всего используются характеристики вирусов, полученные в результате электронно-микроскопических и иммунологических исследований: морфология, структура и размеры вириона, наличие или отсутствие внешней оболочки (суперкапсида), антигены, внутриядерная или цитоплазматическая локализация и др. Наряду с упомянутыми признаками учитываются резистентность к температуре, pH, детергентам и т.д. В настоящее время вирусы человека и животных включены в состав 18 семейств. Принадлежность вирусов к определенным семействам определяется типом нуклеиновой кислоты, ее структурой, а также наличием или отсутствием внешней оболочки. При определении принадлежности к семейству ретровирусов обязательно учитывается наличие обратной транскриптазы. 5. Принцип работы и устройство люминиесцентного микроскопа. По своей сути флюоресцентный микроскоп – этот обычный световой микроскоп. Свои свойства он приобретает лишь благодаря нескольким особенностям. В качестве осветителей в нем используется ртутно-кварцевая или галогеновая кварцевая лампа. Она излучает ультрафиолетовый или синий свет, необходимый для возникновения люминесценции. На люминесцентный микроскоп всегда установлены светофильтры: пропускающий, теплозащитный и запирающий. Первый установлен перед источником света и необходим для пропуска возбуждающих люминесценцию ультрафиолетовых лучей и отсечения остального спектра. Второй служит для защиты оптики и препаратов от перегрева. Третий располагается на окуляре, поглощает ультрафиолетовое излучение и пропускает только свет люминесценции. В основе метода лежит явление люминесценции, сущность которого в том, что поглощая различные виды энергии (световую, электрическую) атомы некоторых веществ переходят в возбужденное состояние, а затем, возвращаясь в исходное состояние, выделяют поглощенную энергию в виде светового излучения. Люминесценция наблюдается в виде флуоресценции - свечение, возникающее в момент облучения возбуждающим светом и прекращающееся сразу после его окончания. Фосфоресценция – свечение продолжающееся длительное время и по окончании процесса возбуждения. 6. Специфическая профилактика и мероприятия по борьбе с вирусными респираторными заболеваниями в животноводческих комплексах. 7. В практике эпизоотологии увеличение размеров и плотности поголовья животных возрастает риск появления эпизоотий. Главным принципом в борьбе с ними является разрыв инфекционной цепи во всех участках или прекращение перехода эпизоотического процесса в скрытое состояние. Одним из главных инструментов разрыва цепи является своевременная профилактика. Для животноводства, развивающееся на промышленной основе борьба со всеми факторами, в.т.ч. с патогенными МО и вирусами является одним из важнейших условий благополучного поголовья. ИП (иммунопрофилактика) при ее правильном включении в стратегию борьбы с инфекционными болезнями значительно уменьшает опасность. Целью ИП являются не только искоренение инфекционных болезней, но и сохранение продуктивности, поэтому необходимо стремиться к созданию таких вакцин, которые способны обеспечить высокую степень защиты всего поголовья сразу после вакцинации, не зависимо от возраста животных. ИП имеет ряд преимуществ: 1.Принцип действия ИП основан на специфическом изменении организма животного в сторону максимального снижения возможности для возбудителя вызвать инфекционное заболевание. 2.ИП действует непрерывно и долго, иногда всю жизнь. 3.ИП не только изменяет реактивность организма животного, но и повышает способность к иммунной защите у всего поголовья. 4.Действие ИП на эпизоотический процесс может быть точно рассчитано. 5.При соответствующем выборе моментов прививки ИП обеспечивают максимальную защиту в самые опасные для заражения периоды жизни. 6.ИП можно увязать с технологическим процессом в животноводстве. 7.Используемые для ИП препараты можно дозировать, применять в разных сочетаниях и стандартизировать. 8.В отличие от АБ и химических препаратов ИП не вызывает явления резистентности у МО. 9.ИП требует меньших экономических затрат, затрат сырья. 10. ИП не оказывает никакого влияния на качество продукции животных. Отрицательные стороны: 1.Пероценка возможностей ИП. Владелец животного часто убежден, сто с проведением вакцинации уже все сделано для защиты, что приводит к ослаблению санитарно-гигиенических мер. 2.Слишком большое возрастание конечной стоимости продукции. 3.После прививочные реакции, которые в течение определенного времени снижает продуктивность, если используется недостаточно отработанная вакцина. 4.Слишком частое беспокойство животных, ведущее к снижению продуктивности. 5.Возникновение диагностических проблем и возрастание трудности в борьбе с заболеваниями, если вакцинные и патогенные штаммы в обычных условиях не различаются или различаются с большим трудом. Нецелесообразное применение вакцин может принести вред, поэтому для каждой конкретной инфекционной болезни и эпизоотической ситуации надо продуманно выбрать вакцину и вариант ее применения с учетом экономических затрат и эффективности, чтобы обеспечить наивысший результат массовых прививок. Иммунопрофилактика сложилась на основе давнего опыта человечества, согласно которому люди, перенесшие инфекционные заболевания вторично ими не заболевали. Раньше, когда в Афинах была чума человека. Фукидид сообщал, что больные оставались без помощи если бы за ними не ухаживали выздоравливающие люди. В Китае в 16 веке при оспе человека был обычай: вдыхать через нос высушенные растертые оспенные корочки. Дженер изобрел вакцину от оспы. Пастер предложил способ вакцинации против бешенства. Профилактика вирусных болезней строится на тех же принципах, что и профилактика других инфекционных болезней: 1.Проведение организационных мероприятий. 2.ИП 3.Химиопрофилактика. Специфическая профилактика вирусных болезней обеспечивается применением живых, инактивированных, поли- и моновалентных сывороток. Классификация и характеристика иммунопрепаратов: Биопрепараты – продукты биологического происхождения, используемые для активной и пассивной ИП. Препараты для пассивной ИП – для парентерального и перорального введения АТ или Ig. С целью проведения ИП применяют иммунные, гипериммунные сыворотки, реконвалесцентную и аллогенную сыворотки. Реконвалесцентная сыворотка – сыворотка доноров переболевших или инфицированных животных. Ее используют, когда нет более эффективных средств в дозе 1мл\кг массы тела. Гипериммунные сыворотки – сыворотки доноров, которые получают в результате однократного введения по определенной схеме массированных доз АГ. Подбирают здорового донора, не болевшего ранее этим заболеванием. Его вакцинируют и через 2-3 недели начинают вводить по определенной схеме в нарастающих дозах, доводят до пика нарастания АТ. Пик определяют путем постановки серологической реакцией на титр АТ (сыворотку проверяют на стерильность, активность и безвредность. Доза 2 мл\кг (лечебная), 1- 1,5 мл\кг (профилактика). Вводят дробно. Сначала вводят сенсибилизированную дозу, а через 2-3 часа – разрешающую дозу, чтобы избежать анафилактического шока. Гамма-глобулины получают из гипериммунных сывороток путем освобождения от балластных белков. Их вводят п\к или в\м в дозе 0,5-2 мл\кг. Сначала вводится сенсибилизация, затем разрешающая доза. Аллогенная сыворотка – сборная сыворотка, которую получают от разных животных в условиях одного хозяйства. Она содержит большой набор АТ и различных АГ. Препараты для активной иммунизации – вакцины. Существуют живые и инактивированные вакцины. Вакцины также классифицируют по: 1) Исходному вируссодержащему материалу – тканевые, эмбрион-вирус вакцины, культуральные вирусовакцины; 2) по методу аттенуации – лапинизированные (против ящура, чумы КРС и другого, используют кроликов), капринизированные (через организм козы, против оспы овец пассажированием через несколько коз, против КРС), овинизированные (через овец – против чумы КРС, ящура). Методы введения вакцин: 1.Подкожно 2.Внутримышечно 3.Аэрозольное 4.Ректальный метод 5.Интраназально 7. Цель и методы получения крови и отдельных ее компонентов у лабораторных животных. Небольшое количество крови получают у кроликов и морских свинок из вен уха, у мышей и крыс—из вен хвоста, а большие количества — из сердца. В особых случаях прибегают к полному, или тотальному, обескровливанию, после которого животное погибает. Для пункции сердца животных фиксируют к доске брюшком кверху. Шерсть в области груди тщательно выстригают, кожу обрабатывают спиртовым раствором йода и после этого приступают к проколу. Тотальное обескровливание. Вскрывают одну из сонных артерий, расположенных по обеим сторонам трахеи. Взятие крови из вены уха. Для получения крови из краевой вены нужно, прежде всего, вызвать гиперемию уха, потирая его ладонями рук и слегка ударяя кончиками пальцев. Затем вдоль наружного края уха удаляют пушок и протирают ватой, увлажненной 70% спиртом. Если в результате всех перечисленных процедур сосуды не инъецируются, ухо смазывают ксилолом или толуолом. После того как сосуды набухнут и четко обозначатся на поверхности ушной раковины, наружную поверхность ее покрывают тонким слоем жидкого парафина (во избежание быстрого свертывания крови) и делают прокол вены. Кровь должна стекать по стенке пробирки по избежании разрушения эритроцитов и при необходимости немедленно смешиваться с достаточным количеством антикоагулянта. В зависимости от задач исследования анализу подвергают цельную кровь, плазму или сыворотку. В цельной крови определяют морфологические показатели, а также содержание глюкозы, кетоновых тел, меди, цинка, кобальта, марганца, селена и др., т.е. веществ, равномерно распределенных между плазмой и эритроцитами. Для исследования веществ, неравномерно распределенных между клетками и жидкой частью крови, следует использовать сыворотку или плазму. В сыворотке, например, исследуют общий белок и его фракции, остаточный азот, мочевину, свободные аминокислоты, липиды, холестерин, билирубин, кальций, неорганический фосфор, магний, йод, связанный с белком (СБЙ), каротин, витамины, ферменты и др. В плазме - резервную щелочность, содержание натрия, калия, неорганического фосфора, магния, каротина, витаминов А, С и др. Для получения пробы цельной крови или плазмы ее стабилизируют, т.е. в пробирку вносят противосвертывающее вещество - антикоагулянт. Антикоагулянты лучше применять в виде растворов. Для получения сыворотки пробирки с кровью рекомендуется в процессе взятия крови помещать в термостат с температурой до 38°С. При массовых обследованиях животных таким импровизированным термостатом может быть достаточная емкость с водой указанной температуры. После завершения работ по взятию крови, свернувшиеся пробы обводят тонкой спицей из нержавеющей стали для лучшего отделения сыворотки и ставят в термостат при 37-38°С на 1-2 часа для окончательного отделения сыворотки. Сыворотку сливают и центрифугируют 20 минут при 2000-3000 об/мин. Для получения плазмы кровь с антикоагулянтом центрифугируют 20-30 минут при 2000-3000 об/мин. Плазма крови отличается от сыворотки наличием фибриногена. 8. |