1. Классификация микроорганизмов по морфологическим свойствам, и их расположение в мазке. Привести примеры. Шаровидныебактери и
 Скачать 265.13 Kb.
|
|
23. Конъюгация, определение, постановка опыта, интерпретация результатов Конъюгация — перенос генетического материала из клетки- донора в клетку реципиента при их скрещивании. Процесс конъюгации у бактерий был впервые обнаружен Д. Ледербергом и Э. Тейтумом в 1946 г. Позднее было показано, что донорами генетического материала являлись клетки, несущие F-плазмиду (поло- вой фактор) (см. 6.6). Бактериальные клетки, не имеющие F-плазмиды, не способны быть генетическими донорами. Они являются реципиентами генетического материала и обозначаются как F -клетки. При скрещивании F+- с F '-клеткой половой фактор передается независимо от хромосомы донора с высокой частотой, близкой к 100%. При этом почти все реципиентные клетки получают половой фактор и становятся Р+-клетками. При коньюгации происходит односторонний процесс переноса генетического материала от донора реципиенту. Необходимым условием для коньюгации должно быть наличие у донора специфического фактора плодовитости (фактора фертильности), обозначаемого F. У грамотрицательных бактерий обнаружены половые (F-пили) волоски, контролируемые F – фактором. Через F-пили при коньюгации происходит перенос генетического материала. При коньюгации происходит перенос не всего нуклеотида, а лишь определенных его частей. Постановка опыта. Для постановки классического опыта конъюгации используют взаимно дополняющие друг друга по двум признакам донорский и реципиентный штаммы E. coli. Бульонные культуры донора и реципиента объемом 0,5 мл смешивают, смесь инкубируют 30 мин при 37С. Для выделения рекомбинантных клеток, смесь высевают на минимальную (глюкозосолевую) среду со стрептомицином. В качестве контроля на среду засевают донорский и реципиентный штаммы, которые не способны расти на ней, так как первый штамм чувствителен к стрептомицину, а второй – не синтезирует лейцин. 24.Трансдукция, определение, постановка опыта, интерпретация результатов Передача генетического материала от одних бактерий другим с помощью фагов называется трансдукцией. Этот вид генетического обмена открыт Н. Циндером и Дж. Ледербергом в 1951 г. Различают три типа трансдукции: неспецифическую или общую, специфическую и абортивную. Неспецифическая трансдукция. В процессе репродукции фага в момент сборки фаговых частиц в их головку вместе с фаговой ДНК может проникнуть какой-либо фрагмент ДНК бактерии-донора. При этом фаг может утратить часть своего генома и стать дефектным. Такие дефектные трансдуцирующие фаги составляют примерно 0,3% всего потомства. При неспецифической трансдукции в клетки реципиентного штамма вместе с фаговой ДНК могут быть перенесены любые гены донора, например гены, контролирующие способность синтезировать аминокислоты, пурины, пиримидины, гены резистентности к антибиотикам или др. Принесенный фагом фрагмент ДНК бактерии-донора способен включаться в гомологическую область ДНК клетки-реципиента путем рекомбинации. Таким образом, при неспецифической трансдук- ции трансдуцирующие фаги являются только переносчиком генетического материала от одних бактерий к другим, поскольку сама фаговая ДНК не участвует в образовании рекомбинантов (трансдуктантов). Специфическая трансдукция характеризуется способностью фага переносить определенные гены от бактерии-донора к бактерии реципиенту. Это связано с тем, что образование трансдуцирующего фага происходит путем выщепления профага из бактериальной хромосомы вместе с генами, расположенными на хромосоме клетки донора рядом с профагом. Абортивная трансдукция. При абортивной трансдукции принесенный фагом фрагмент ДНК бактерии-донора не включается в хромосому бактерии-реципиента, а располагается в ее цитоплазме и может в таком виде функционировать. Во время деления бактериальной клетки трансдуцированный фрагмент ДНК-донора может передаваться только одной из двух дочерних клеток, т.е. наследоваться однолинейно и в конечном итоге утрачиваться в потомстве. Механизм трансдукции: в процессе репродукции некоторых умеренных фагов небольшие фрагменты ДНК бактерий-доноров встраиваются в геном фага, который переносит их в бактерии-реципиенты. Различают 3 типа трансдукции: генерализованную (общую), специфическую и абортивную. При общей трансдукции происходит перенос любого маркера или нескольких маркеров. При специфической трансдукции передается тесно сцепленная группа генов, контролирующая утилизацию галактозы, и не передаются гены, детерминирующие утилизацию других углеводов, способность синтезировать аминокислоты, чувствительность к антибиотикам и др. Для абортивной трансдукции характерной особенностью является то, что внесенный фагом фрагмент нуклеотида не включается в нуклеотид реципиента; он локализуется в цитоплазме и при делении передается только одной дочерней клетке, вторая клетка содержит генетический аппарат реципиента. Постановка опыта трансдукции. Смешивают по 1 мл трехчасовой бульонной культуры реципиента и трансдуцирующего фага. Смесь инкубируют 60 мин при +370С, готовят серию десятикратных разведений. Из пробирки с разведением 10-6 по 0,1 мл культуры высевают на среду Эндо и инкубируют в течение суток. Рекомбинантные клетки растут с образованием малиновых с металлическим оттенком колоний. 25. Трансформация, определение, постановка опыта, интерпретация результатов Трансформация — непосредственная передача генетического материала (фрагмента ДНК) донора реципиентной клетке. Впервые воспроизведена Ф. Гриффитсом в 1928 г. в опытах с авирулентным бескапсульным штаммом пневмококка, который приобрел вирулентные свойства при одновременном введении в брюшную полость белых мышей с убитыми капсульными вариантами этих же бактерий. В дальнейшем было показано, что вирулентные свойства передаются in vitro при обработке авирулентных бескапсульных пневмококков экстрактом убитых капсульных пневмококков. В 1944 г. О. Эвери, К. Мак-Леод и К. Мак-Карти установили, что активным началом, содержащимся в экстракте убитых пневмококков, является ДНК, которая определяет его генетические свойства и является носителем генетической информации. Трансформирующей активностью обладают двунитевые фрагмент ДНК. Процесс трансформации бактерий можно подразделить на несколько фаз: 1) адсорбция ДНК-донора на клетке-реципиенте; 2) проникновение ДНК внутрь клетки-реципиента; 3) соединение ДНК с гомологичным участком хромосомы реци- пиента с последующей рекомбинацией. После проникновения внутрь клетки трансформирующая ДНК деспирализуется. Затем происходит физическое включение любой из двух нитей ДНК донора в геном реципиента. Эффективность спаривания трансформирующей ДНК с соответствующим участком хромосомы реципиента зависит от степени гомологичности ДНК донора и реципиента. Чем выше гомологичность, тем эффективнее спаривание, что определяет конечный результат трансформации, т.е. количество формирующихся рекомбинантов (трансформантов). Отсюда ясно, почему межвидовая трансформация происходит гораздо реже, чем внутривидовая. Для проведения опыта необходимы следующие материалы: -реципиент - штамм Bacillus subtilis,чувствительный к стрептомицину; - ДНК донора – выделяют из штамма B. subtilis (strr), устойчивого к стрептомицину; - селективная среда - МПА со стрептомицином. Постановка опыта трансформации. Смешивают по 1мл бульонной культуры B. subtilis и ДНК донора. Инкубируют 30 мин при +370С, и высевают на МПА и МПА со стрептомицином. Рекомбинантные штаммы способны расти на селективной среде со стрептомицином. Частота трансформаций равна отношению количества рекомбинантных клеток к реципиентным. Интерпретация результатов: На следующий день учитывают результаты опыта и определяют частоту трансформации по отношению количества выросших рекомбинант-ных клеток к числу клеток реципиентного штамма. 26.Стафилакокки. Опишите его морфологические, тинкториальные, культуральные свойства. Факторы патогенности. Роль данного микроорганизма в возникновении внутрибольничных инфекций. S.aureus. Отдельные клетки стафилококков,имеющие форму правильного шара, Грам положительные, при размножении образуют скопленияв виде гроздьев винограда (staphyle— виноградная грозд. В препаратах из патологического материала, в частности из гноя стафилококки располагаются парами или небольшимископлениями. Золотистые стафилококки образуют микрокапсулу. Стафилококки — факультативные анаэробы, но лучше развиваются в аэробных условиях. На поверхности плотных питательных сред образуют круглые, выпуклые, пигментированные (золотистые, палевые, лимонно-желтые, белые) колонии с ровными краями; в жидких средах дают равномерное помутнение. В лабораториях используют способность стафилококков размножаться в средах с большим количеством (6-10%) хлорида натрия. Такую концентрацию соли другие бактерии не переносят, вследствие чего солевые среды являются элективными для стафилококков. Штаммы золотистых стафилококков, продуцирующие гемолизины дают на кровяномагаре колонии, окруженные зоной гемолиза.Факторы вирулентности стафилококков, особенно S. aureus, связаны с их адгезией на рецепторах чувствительных клеток, колонизацией и агрессивными свойствами, проявляющимися н подавлении фагоцитоза. Существенную роль в патогенезе заболеваний играют плазмокоагулаза, гиалуронидаза, лецитиназа, фибринолизин, ДНК-аза. Стафилококки секретируют ряд токсинов, отличающихся друг от друга по механизму действия. К ним относятся мембраноповреждающиетоксины или мембранотоксины. Они образуют каналы в цитоплазматической мембране эритроцитов, лейкоцитов и других клеток, что приводит к нарушению осмотического давления и лизису соответствующих клеток. Ранее их называли гемолизинами, полагая, что они лизируют только эритроциты. Мембранотоксины отличаются друг от друга по антигенным свойствам, ≪мишени≫ и другим признакам, її-токсин обладает еще дермонекротическим и кардиотоксическим действием. Он представляет собой белок с выраженными иммуногенными свойствами. Из него получен анатоксин, использующийся для лечения и профилактики стафилококковых заболеваний. (3-токсин наряду с мембраноповреждающим действием на эритроциты и соединительные тканные клетки, угнетает хемотаксис полиморфно-ядерных лейкоцитов, х-токсин разрушает эритроциты, лейкоциты и клетки соединительной ткани. Золотистые стафилококки могут образовывать гистотоксины, к которым относятся энтеротоксины, вызывающие пищевую интоксикацию. Известно 6 энтеротоксинов (А, В , С, D, Е, F), различающиеся по антигенным свойствам. Некоторые стафилококки продуцируют экзотоксин, вызывающий <синдром ≪токсического шока≫. Роль данного микроорганизма в возникновении внутрибольничных инфекций: В настоящее время наиболее актуальными являются такие этиологические агенты ВБИ как стафилококки, грамотрицательные условно-патогенные бактерии и респираторные вирусы. Для каждого лечебного учреждения характерен свой спектр ведущих возбудителей ВБИ, который в течение времени может изменяться. Например, в: крупных хирургических центрах ведущими возбудителями постоперационных ВБИ были золотистый и эпидермальный стафилококки, стрептококки, синегнойная палочка, энтеробактерии; ожоговых стационарах – ведущая роль синегнойной палочки и золотистого стафилококка; детских стационарах большое значение имеет занос и распространение детских капельных инфекций – ветряной оспы, краснухи, кори, эпидемического паротита. 27.Стрептококки. Морфологические и тинкториальные свойства. Факторы патогенности. Вызываемые заболевания. Методы лабораторной диагностики. Клетки шаровидной или овальной формы, расположенные попарно или в виде цепочек разной длины. Грамположительны. О-стрептолизин— термолабильный белок, выделяемый при размножении клеток, вызывает лизис эритроцитов, разрушает мембраны других клеток, а также мембраны лизосом. Обладает кардиотоксическим действием и является антигеном. К нему синтезируются анти-О-стрептолизины. S-стрептолизин— нуклеопротеид, не обладающий антигенными свойствами, лизирует эритроциты, разрушает лизосомы. Освобождающиеся при этом ферменты вызывают деструкцию тканей и разрушают мембрану митохондрий. Цитотоксины— пептиды, повреждающие клетки некоторых тканей. Им приписывают прямое и иммуноопосредованное действие на почечные клубочки, что приводит к развитию гломерулонефрита. Чаще всего при данном заболевании выделяют S. pyogenes 12 серотипа, который называют нефритогенным стрептококком. Кардиогепатический токсин, секретируемый некоторыми штаммами S. pyogenes, участвует в поражении миокарда и образовании гранулем в печени. Эритрогенные токсины (эритрогенины) — продуцируются только лизогенными штаммами стрептококков трех серогрупп: А, В и С. Из ферментов, продуцируемых S. pyogenes, следует выделить стрептокиназу (фибринолизин), способствующую растворению фибрина, ограничивающего местный воспалительный очаг, нарушение которого может привести к генерализации инфекции; иГиалуронидазу, обеспечивающую инвазию бактерий, которая обладает антигенными свойствами. Кроме того, стрептококки секретируют ДНК-азу, РНК-азу, АТФ-азу, роль которых в патогенезе стрептококковых инфекций не совсем ясна. Полагают, что эти ферменты подавляют активность фагоцитов. Стрептококки имеют несколько типов антигенов, позволяющих дифференцировать их друг от друга. По Р. Лэндсфилд (1933 г), их подразделяют на 17 серогрупп по полисахаридным антигенам, которые обозначаются заглавными латинскими буквами А, В, С, D, Е, F и т.д. К самой многочисленной серогруппе Аотносится вид S.pyogenes. Дифференциация на серотипы проводится по белковому М-антигену. Сейчас насчитывается свыше 100 серотипов стрептококков серовара А.Вызывают многочисленные гнойно-воспалительные процессы в разных органах и тканях, воспаления, не сопровождающиеся обильнымгноеобразованием, а также генерализованные формы инфекции — сепсис, скарлатина, послеродовые и урогенитальные инфекции, маститы и вагиниты у женщин, сепсис и менингиты у новорожденных. Вызывают раневую инфекцию, гнойно-воспалительные заболевания желчно-выводящих путей, эндокардиты, перитониты, уроинфекции.Материал для исследования: гной, слизь из зева и носа, моча и др. — подвергают бактериоскопическому исследованию. Для этого готовят мазки, которые окрашивают по Граму. Бактериологическое исследование проводят путем посева исследуемого материала на чашки Петри с кровяным агаром. Выросшие колонии характеризуют по наличию или отсутствию гемолиза. Заключительным этапом бактериологического исследования является идентификация выделенной культуры по антигенным свойствам в реакции преципитации с полисахаридным преципитиногеном,выделенным из исследуемой культуры, и антисыворотками к серотипам А, В, D. При подозрении на сепсис делают посевы крови. Серологическое исследование проводят для подтверждения диагноза ревматизма. С этой целью определяют наличие антител к О-стрептолизину в РСК или реакции преципитации, а также С-реактивного (белка. В последние годы для диагностики стрептококковых инфекций используют ПЦР. 28.Кишечные палочки. Опишите морфологические, тинкториальные свойства микроорганизма, имеющего данные культуральные свойства. Роль микроба в развитии инфекционной патологии человека. Принципы этиотропного лечения и профилактики. По своим морфологическим и тинкториальным свойствам Е. coli напоминает другие энтеробактерии. Среди кишечных палочек встречаются подвижные и неподвижные варианты. Некоторые штаммы имеют выраженную капсулу или микрокапсулу и формируют на плотной среде S- и R-формы колоний. Е. coli — Грам негативный, факультативный анаэроб, хорошо растет на обычных питательных средах при слабощелочной реакции среды и оптимальной температуре 37°С. По патогенетическим и эпидемиологическим особенностям вызываемых Е. coli заболеваний их можно подразделить на две группы: 1. Возбудители эндогенных инфекций — гнойно-воспалительных процессов различной локализации. К ним относятся пиелиты, циститы, холициститы и др., за исключением нагноения ран. Последние относятся к экзогенной инфекции, возникающей преимущественно в ассоциациях с другими бактериями (Staphylococcus, Proteus, Pseudomonasaeruginosa и др.). Все перечисленные инфекции нередко классифицируют как коли-бактериозы, вызываемые условно-патогенными бактериями. Е. coli при выраженном иммунодефиците могут вызвать сепсис. 2. Возбудители острых кишечных инфекций (ОКЗ), которые представляют собой типичные экзогенные инфекции, называемые эшерихиозами (диареи). Их подразделяют на четыре группы: а) ЭПКП — возбудители коли-эитеритов,вызывающихсальмонеллоподобныеинфекции; б) ЭТКП, вызывающие холероподобныеинфекции; в) ЭИКП, вызывающие дизентериеподобные инфекции; г) ЭГКП, вызывающие геморрагический колит. Специфический профилактики нет. Важное значение имеет выявление больных и носителей в детских яслях, родильных домах, молочных кухнях и других детских учреждениях, их изоляция и лечение. Для лечения больных детей раннего возраста используют бифидобактерии, лактобактерин — препараты, содержащие молочно-кислые бактерии, являющиеся антагонистами Е. coli. Из антибиотиков используют все препараты, действующие на грамотрицательные бактерии хлорамфеникол, пенициллин и цефалос-порины последних поколений, а также фторхинолон. 29.Дизентерия. Опишите морфологические, тинкториальные, культуральные свойства возбудителя заболевания. Пути передачи инфекции. Методы лабораторной диагностики. Пинципы профилактики. Шигеллы Грам негативные палочки. Они лишены жгутиков и поэтому являются неподвижными бактериями. Многие штаммы шигеллимеют пили. Различные виды шигелл идентичны по своим морфологическим свойствам. Возбудители дизентерии хемоорганотрофы, нетребовательны к питательным средам. На плотных средах при выделении из организма больного образуются, как правило, S-формы колоний. Шигеллы вида Shigellasonnei образуют два типа колоний — S-(I фаза) и R-формы. Средой обитания шигелл является толстая кишка человека, в энтероцитах которой они размножаются. Источником инфекции являются больные, люди и бактерионосители. Заражение происходит при приеме инфицированной пищи или воды. Таким образом, основной путь передачи инфекции — алиментарный. Однако описаны случаи контактно-бытовой передачи. Выделяют чистую культуру возбудителя путем посева фекалий больного на дифференциально-диагностическую питательную среду (среда Плоскирева, Левина и др.) с последующей ее идентификацией на средах пестрого ряда и по антигенным свойствам в реакции агглютинации для определения вида и серовара. Процент положительных результатов довольно низкий, особенно при хронической дизентерии. Получение различных вакцин (гретые, формалинизированные, химические) не решило проблему специфической профилактики дизентерии, поскольку все они обладали низкой эффективностью. Для лечения применяют фторхинолоны и реже — антибиотики. |