ШПОРА Микробиология. Шпаргалка на экзамен. 24 Классификация антител. Принцип деления антител на классы
 Скачать 1.48 Mb.
|
|
6 Сущность и этапы бактериологичегого метода исследования. Бактериологический метод – это выделение чистой культуры микробов из исследуемого материала и ее идентификация. Этапы. I этап – выделение чистой культуры. 1-ый день. Исследуемый материал: а) ориентировочная микроскопия по Граму. б) плотная МПА (37С, 24часа). Цель 1-го дня: получить изолированные колонии. Колония – потомство одной клетки выращенное на плотной питательной среде. 2-ой день. 1. Макроскопическая хар-ка колоний. Параметры: цвет, форма, размер, хар-р краев, хар-р поверхности, консистенция (крошковидная, плотная, слизистая, кородирующая). 2. Микроскопическая хар-ка. Из намеченной колонии приготовлен мазок, окрашен по Граму. 3. Из намеченной колонии делают посев на скошенный агар для получения ЧК (37С, 24часа). II этап – идентификация выделенной культуры. 3-ий день I. Идентификация: 1. Проверка чистоты выделенной культуры. Приготовлен мазок, окрашен по Граму (морфологические свойства). 2. Определение биохимической активности: ферментация углеводов и белков (культуральные свойства). 3. Сероидентификация (по а/г). 4. Факторы вирулентности (вирулентность – степень болезнетворности микроба обуслевленная факторами инвазивности и токсичности). 5. Фаготипирования ( определение чувствительности бактерий к бактериофагу, который вызывает лизис этой культуры.) II. Определение чувствительности к антибиотикам. 4-тый день. Учет результатов: 1 Определение вида по биохимической активности. 2 Определение чувствительности исследуемой культуры к антибиотикам. | |||
| 20 Варианты постановки реакции агглютинации. Реакция агглютинации (серологическая реакция) – склеивание клеток под действием а/т в присутствие электролита. Специфический фактор: 1. А/г – взвесь клеток (эритроциты, убитые и живые микробы). 2. А/т – агглютинирующая сыворотка (иммунизируют кролика взвесью соответствующих клеток). Неспецифический фактор – 3. 0,85% NaCl – электролит который делает реакцию видимой. С помощью реакции агглютинации можно определить неизвестный вид микроба – сероидентификация, или выявить титр (количество) а/т – серодиагностика. Варианты постановки - 1 Реакция агглютинации на стекле – ставится с одним развидением диагностической агглютинирующей сыворотке, которая в зависимости от ее титра составляет 1:10, 1:25, 1:50, или 1:100. Предметное стекло делят на квадраты. В один из них наносят каплю NаСl, в другой каплю сыворотки. Затем петлей в каждую каплю вносят бактериальные культуры и перемешиваю до равномерной взвеси. Далее наблюдают за появлением зерен и хлопьев агглютината (этим самым мы определяем видовую принадлежность). Учет через 3-5 мин. Для определения серовара необходимо поставить р-цию агглютинации с типоспецифическими сыворотками. 2. При постановки развернутой реакции агглютинации определяем титр а/т (это максимальное разведение, в котором обнаруживается агглютинация а/г), у пациента с целью диагностики заболевания. Диагностический титр при брюшном тифе 1:200. Реакция агглютинации положительна при титре 1:100. Для уточнения диагноза необходимо поставить повторную реакцию через 5 дней. | 4 Способы микроскопического изучения вирусов. 1 Электронная микроскопия позволяет изучить закономерности взаимодействия вируса и клетки, этапы морфогенеза вирусов в процесси репродукции. 2 Метод напыления металлами применяют для получения контрасных препаратов. Метод создает объемность изображения, позволяет хорошо изучить форму и величину вирусов, строение их поверхности, но внутренняя структура вируса недоступна. 3 Световая микроскопия, используется для изучения окрашенных объектов в фиксированных препаратах. 4 Темнопольная микроскопия применяют для прижизненного изучения микробов в нативных неокрашенных препаратах. 5 Фазово - контрастная микроскопия предназначена для изучения нативных препаратов. Фазово – контрастная приспособление дает возможность увидить прозрачные объекты. 6 Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия возникает в результате окрашивания препаратов специальными люминесцирующими красителями – флюорохромами. Этот метод позволяет исследовать живые микробы. 7 Электронная микроскопия. Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа. Применяют для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов. | 19 Способы культивирования анаэробов. Все манипуляции с анаэробами осуществлятся в бескислородных условиях. Для этого используют герметичные камеры с газовым составом среды. Посевы производят на специальные обогатительные (элективные) среды для анаэробов (тиогликолевую, Китта—Тароцци). Посевы инкубируют в специальных СО2-инкубаторах или в анаэростатах, которые помещают в обычный термостат. Для инкубации небольших по объему посевов (1—2 чашки Петри) применяют пластиковые пакеты, содержащие газовую смесь, которая обеспечивает полное удаление кислорода из воздушной среды в течение нескольких минут. | 29 Постановка и использование, реакции торможения гемагглютинации. РТГА (р-ция торможения гемагглютинации) является вариантом р-ции нейтрализации вируса. Она основана на способности противовирусной антисыворотки подавлять вирисную гемагглютинацию эритроцитов определенных видов животных (кур, гусей и др.). Это объясняется способностью специфических антисывороток нейтрализовать вируные гемагглютинины, т.е проводят типирование вируса в РТГА с набором типоспецифических сывороток. РТГА широко применяется для идентификации и типирования вирусов, а также для выявления антигемагглютининов в сыворотке крови исследуемых людей. |
| 18 Метод культуры ткани. Для выделения чистой культуры вируса из иследуемого материала применяют различные типы однослойных клеточных культур, а также куриные эмбрионы. Идентификацию вируса производят по ЦПД (появление гигантских многоядерных клеток). Характерное появление очагов избыточного роста клеток, приводит к образованию бляшек, изменению формы клеток с последующей дегенерацией и слущиванием монослоя. В зараженных клетках выявляются характерные включения. При зарожении куриных эмбрионов, в положительном случае через 3-е суток наблюдается появление характерных белесоватых, непрозрачных выпуклых бляшек. Бляшка – это как бы колонии вирусов, которые вызвали гибель клетки. Сосчитав количество бляшек, можно определить количество вируса в материале. БОЕ (бляшко – образующее единица) используется для определения количества вируса в вакцине. Для выявления вируса также применяется цветная проба. Если в культуре клетки произошла репродукция вируса, то рН среды не меняется, т.к клетки погибли, и цвет среды не меняется.. Если репродукция не произошла, клетки живы выделяют метаболиты и изменяется рН. Для идентификации используют методы РТГА, ИФА позволяющие обнаружит вирусные а/г в зараженной культуре. | 23 Методика постановки реакции связывания комплемента. РСК идет в 2-ух р-циях: 1.Р-ция гемолиза – это р-ция растворение эритроцитов при взаимодействии с гемолизинами (а/т) в присутствии комплемента. Компаненты: 1 а/г (эритроциты барана) 2. а/т – гемолитическая сыворотка (кролика иммунизируют бараними эритроцитами) 3. Комплемент (сыворотка морской свинки). Комплемент делает р-цию видимой т.е делает гемолиз. 2. Р-ция лизиса – растворение клеток при взаимодействии с а/т в присутствии комплемента (причиной лизиса явл-ся комплемент) в его активации и образовании МАК. Р-ция гемолиза используется как индикатор свободного или связанного комплемента в РСК. В контроле комплемент всегда свободен, т.к отсутствует образование комплекса а/г+ а/т т.е в пробирках “лаковая кровь” (гемолиз+). Если идет р-ция лизиса т.е нет гемолиза - РСК+, то человек болен. Если идет р-ция гемолиза (гемолиз+) – РСК-, то человек здоров. Результат р-ции зависит от кол-ва комплемента. Исследуемую сыворотку необходимо подогреть при t 56С – 30мин для иноктивации (разрушения). Комплемент (сыворотка) берут в строго определенном кол-ве – в рабочей дозе – это титр увеличенный на 25%. Титр – это минимальное кол-во комплемента необходимое для гемолиза. РСК используют при диагностике вирусных инфекций, бруцилезе, р-ция Вассермана. | ||
| 1 Способы приготовления мазков для микроскопии. Техника приготовления мазков. Мазки готовят на обезжиренных предметных стеклах, предварительно обрисовав карандашом по стеклу место будущего мазка с противоположной стороны предметного стекла. При росте бактерий на жидкой питательной среде, материал берут стерильной бактериальной петлей, наносят на стекло и растирают над очерченной площадкой. В случае роста бактерии на плотной питательной среде, на предметное стекло предварительно наносят спичкой каплю воды и материал растирают рядом с каплей посуху, а затем вносят петлей воду, постепенно готовя однородную взвесь. Бактериальную петлю перед использованием и с оставшейся культурой стерилизуют в пламени горелки: Приготовленный мазок высушивают на воздухе или держа высоко над пламенем спиртовки. После этого препарат фиксируют, для чего мазок стороной, где нет материала, троекратно проводят через середину пламени горелки. Фиксация позволяет убить микробы, прикрепить их к стеклу и, наконец убитые микробы окрашиваются лучше, чем живые. | 22 Методика постановки реакции бактериолиза. Реакция бактериолиза — растворение бактерий в присутствии специфических антител — бактериолизинов и комплемента. Иммунный лизис бактерий можно наблюдать как в организме животного, так и в пробирке. Ингредиенты реакции: живые бактерии, специфические по отношению к ним антитела (иммунная сыворотка или иммунизированное животное), комплемент. Как защитная реакция бактериолиз наиболее выражен при холере, сальмонеллезных инфекциях. Многие виды бактерий не способны к лизису, поэтому реакция бактериолиза применяется редко. Постановка реакции бактериолиза invitro: в опытную пробирку вносят взвесь живых бактерий, специфическую иммунную сыворотку и комплемент, в контрольную пробирку — те же бактерии, нормальную сыворотку (без антител) и комплемент. После двухчасового выдерживания пробирок в термостате при 37°С из каждой пробирки делают высевы по 0,1 мл на чашки Петри с мясопептонным агаром. Опыт учитываю; после суточной инкубации: на чашке с высевом из опытной пробирки колоний должно быть значительно меньше, чем а контроле. | 21 Варианты постановки реакции преципитации. Реакция преципитации (серологическая р-ция) – это осаждение а/г из раствора в присутствии электролита. Компаненты: 1. А/г в коллойдном состояние (экстракт из клеток, моллекулы белка, полисахариды). 2. А/т – преципитирующаяся сыворотка (экстракт из клеток или отдельными а/г ). 3. Электралит 0,9% NаСl (чтобы реакция стала видимой ). Реакция сверхчувствительная и позволяет определить следы а/г или а/т. Варианты постановки:1 Реакция кольцепреципитация – при положительной реакции на границе между сывороткой (а/т) и а/г появляется преципитат в виде белого кольца. 2 Реакция преципитации в геле – чашки заливают агаром, в котором вырезают несколько лунок. В центральную лунку вносят сыворотку содержащую а/т, а в остальные различные а/г. При диффузии реагентов в агаре, на месте встречи а/г и а/т образуются мутные полосы – усы преципитации. 3 Реакция термоприципитации – основана на термостабильности а/г, который получают путем кипячения (сибирская язва, чума). | 26 Способы определения токсигенности культур. Определени токсигенности имеет важное значени при диагностике дифтерии. Токсигенность (способность к продукции дифтерийного токсина) определяют с помощью различных серологических реакций. Определение токсигенности – реакция преципитации в агаре с антитоксической противодифтерийной сывороткой: в чашку Петри с агаром, содержащим лошадиную сыворотку, мальтозу и цистин, кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой. Затем засевают исследуемые культуры в виде перпендикулярных к бумаге штрихов. В качестве контроля используют заведомо токсигенную культуру. Посевы инкубируют при 37"С до следующего дня. При размножении токсигенной культуры в месте соединения токсина с антитоксическими антителами образуется преципитат в виде белых линий "усов". |
| 25 Состав и цели использования минимальной среды. Минемальная среда – это питательная среда содержащая минеральные соли, источники углерода и азота, но не содержащая ростовых факторов. Прототрофы – это микробы, которые из глюкозы и солей амония могут синтезировать себе необходимые вещества. Ауксатрофы – они не могут синтезировать из глюкозы и солей амония необходимые вещества, т.е микроб нуждается в определенных веществах, которые он сам синтезировать не может – это фактор роста. Ауксотрофные штамы в отличии от прототрофных на минимальных средах не растут. Цель – используют в генетики. В генетики этот способ был выделен при коньюгации (передача генетической информации от донора к реципиенту при непосредственном контакте клеток) и трансдукции (передача фрагмента двунитчатой ДНК от донора к реципиенту с помощью мутанта умеренного фага). | 28 Постановка и использование реакции пассивной гемагглютинации. РПГА по сравнению с р-цией агглютинации, обладает более высокой чувствительностью, т.е можно опредилить низкий титр а/т или а/г. Постановка. В лунки с исследуемым материалом вносят одинаковый объем 3% суспензии нагруженных а/т эритроцитов. Через 2 часа инкубации при t 37 учитывают результаты, оценивая внешний вид осадка эритроцитов. Выпадение эритроцитов в осадок в виде зонтика (положительная р-ция). При отрицательной р-ции в лунках видны пуговки. Р-ция а/г + а/т происходит на пов-ти эритроцита (глазу невидно), но образуются крупные комплексы эритроцитов, которые выпадают в осадок. Ее используют для идентификации возбудителя по его антигенной структуре или для идентификации токсинов в исследуемом материале. | 27 Постановка и использование реакции гемагглютинации. РПГА по сравнению с р-цией агглютинации, обладает более высокой чувствительностью, т.е можно опредилить низкий титр а/т или а/г. Постановка. В лунки с исследуемым материалом вносят одинаковый объем 3% суспензии нагруженных а/т эритроцитов. Через 2 часа инкубации при t 37 учитывают результаты, оценивая внешний вид осадка эритроцитов. Выпадение эритроцитов в осадок в виде зонтика (положительная р-ция). При отрицательной р-ции в лунках видны пуговки. Р-ция а/г + а/т происходит на пов-ти эритроцита (глазу невидно), но образуются крупные комплексы эритроцитов, которые выпадают в осадок. Ее используют для идентификации возбудителя по его антигенной структуре или для идентификации токсинов в исследуемом материале. | 12 Метод окраски препаратов по Цилю-Нильсеиу. На фиксированный мазок кладут кусочек фильтр. бумаги, наливают р-р фуксина и подогревают 3-5мин. до появления паров > снять бумагу промыть мазок водой > нанести 5% р-р серной к-ты на 1-2 мин. для обесцвечивания > промыть водой > докрасить мазок водным р-ром метиленового синего в течении 3-5 минут > промыть водой, высушить. |
| 7 Методика получения чистой культуры. Выделение чистой культуры. 1-ый день. Исследуемый материал: а) ориентировочная микроскопия по Граму. б) плотная МПА (37С, 24часа). Цель 1-го дня: получить изолированные колонии. Колония – потомство одной клетки выращенное на плотной питательной среде. 2-ой день. 1. Макроскопическая хар-ка колоний. Параметры: цвет, форма, размер, хар-р краев, хар-р поверхности, консистенция (крошковидная, плотная, слизистая, кородирующая). 2. Микроскопическая хар-ка. Из намеченной колонии приготовлен мазок, окрашен по Граму. 3. Из намеченной колонии делают посев на скошенный агар для получения ЧК (37С, 24часа). | 8 Способы идентификации выделенной культуры. Идентификация: 1. Проверка чистоты выделенной культуры. Приготовлен мазок, окрашен по Граму (морфологические свойства). 2. Определение биохимической активности: ферментация углеводов с образованием к-ты и газа, и белков с образованием индола (культуральные свойства). 3. Сероидентификация (определение а/г у микроба с помощью известных иммунных сывороток т.е известные а/т). 4. Факторы вирулентности (вирулентность – степень болезнетворности микроба обуслевленная факторами инвазивности и токсичности). 5. Фаготипирования ( определение чувствительности бактерий к бактериофагу, который вызывает лизис этой культуры.) | 17 Способы стерилизации питательных сред. Автоклавирование — стерилизация перегретым водяным паром (при повышенном давлении) в паровом стерилизаторе (автоклаве). Многие питательные среды стерилизуют при давлении 1 атм в течение 15—20 мин, питательные среды с углеводами — при 0,5 атм в течение 15 мин. Стерилизация текучим паром осуществляется в автоклаве при незавинченной крышке и открытом выпускном кране. Данный способ стерилизации основан на антибактериальном действии пара в отношении вегетативных клеток. Он применяется в тех случаях, когда стерилизуемый материал не выдерживает высокой температуры, например питательные среды с витаминами, углеводами. | ОКРАСКИ И РЕАКЦИИ 5 1 Способы приготовления мазков для микроскопии 2 Способы приготовления препаратов для изучения подвижности микробов 3 Принцип иммунолюминесцентного исследования материала 4 Способы микроскопического изучения вирусов 5 Способы культивирования вирусов 6 Сущность и этапы бактериологичегого метода исследования 7 Методика получения чистой культуры 8 Способы идентификации выделенной культуры 9 Способы определения чувствительности выделенной культуры к антибиотикам 10 Метод окраски препаратов ио Граму 11 Механизм окраски микробоя по Граму 12 Метод окраски препаратов по Цилю-Нильсеиу 13 Способы определения наличия у бактерий капсулы 14 Способы определения наличия у бактерии спор 15 Способы стерилизации в микробиологии 16 Способы стерилизации лабораторкой посуды 17 Способы стерилизации питательных сред 18 Метод культуры ткани 19 Способы культивирования анаэробов 20 Варианты постановки реакции агглютинации 21 Варианты постановки реакции преципитации 22 Методика постановки реакции бактериолиза 23 Методика постановки реакции связывания комплемента 24 Способ получения и цель применения гемолитической сыворотки 25 Состав и цели использования минимальной среды 26 Способы определения токсигенности культур 27 Постановка и использование реакции гемагглютинации 28 Постановка и использование реакции пассивной гемагглютинации 29 Постановка и использование, реакции торможения гемагглютинации 30 Полимеразоцепная реакция (ПЦР), ИФА |