Державна установа інститут фармакології та токсикології намн україни

• Название: Державна установа інститут фармакології та токсикології намн україни
• Дата: 17.11.2020
• Размер: 0.69 Mb.
• Имя файла: Movchan_d.docx
• Тип: Закон; #151121
• страница: 4 из 15

РОЗДІЛ 2

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1 Характеристика експериментальних тварин
Експериментальні дослідження проведені на 1100 нелінійних білих мишах – самцях та самицях масою 18-24 г та 192 статевозрілих нелінійних білих щурах-самцях масою 180-230 г, які були розведені в ПП «Біомодельсервіс».

Усі миші та щури отримували ad libitum стандартний комбінований корм для лабораторних тварин марки ПК-120-5 виробництва АТЗТ «Фенікс» та питну воду із міського водогону. Відповідно до санітарно-гігієнічних норм у приміщенні підтримували стандартний режим утримання тварин: температура повітря: 22±2ºС, вологість повітря – 50-70%, циклічність освітлення кімнати: 12 годин світла/12 годин темряви [239, 240].

Термін акліматизації тварин тривав 10 діб. Після акліматизації була проведена процедура рандомізованого відбору тварин.

Всі експериментальні процедури проводили відповідно до правил «Європейської конвенції щодо захисту хребетних тварин, яких використовують з експериментальною та іншою науковою метою» (1986), «Положення про використання тварин у біомедичних дослідженнях» (1989) та «Доклінічними дослідженнями лікарських засобів» під редакцією О.В. Стефанова [239, 241, 242].
2.2 Характеристика досліджуваних препаратів та рецепторних аналізаторів нейромедіаторних систем
В експериментах використані наступні лікарські засоби, які вивчались в терапевтичних дозах для тварин згідно літературних даних:

1. Карбамазепін в дозі 125 мг/кг (табл. 200 мг, Карбамазепін-Здоров’я, виробництва ТОВ «Фармацевтична компанія «Здоров’я», Україна) [243].

2. Вальпроат натрію в дозі 155 мг/кг (табл. 500 мг, Депакін Хроно виробництва Sanofi-Aventis, Франція) [244].

3. Ламотриджин в дозі 30 мг/кг (табл. 50 мг, Ламотрин, виробництва ТОВ «Фарма Старт», Україна) [245].

4. Топірамат в дозі 300 мг/кг (табл. 200 мг, Топілепсин, виробництва ТОВ «Фармацевтична компанія «Здоров’я», Україна) [246].

5. Фенобарбітал в дозі 20 мг/кг (Фенобарбітал, субстанція виробництва ТОВ «Харківське фармацевтичне підприємство «Здоров’я народу») [247].

Для досліджень використовували речовини у вигляді гомогенних порошків, отриманих шляхом подрібнення та розтирання таблеток та вмісту капсул у фарфоровій ступці. Оскільки дані лікарські форми не повністю розчиняються у водному середовищі, приготування гомогенних субстанцій проводили з використанням поверхнево-активної речовини – детергенту «Твін-80» у концентрації 0,2%. Суспензії досліджуваних речовин готували безпосередньо перед їх введенням лабораторним тваринам. Розведення готували таким чином, щоб тварини отримували препарат з розрахунку 0,1 мл/10 г маси тіла. Індивідуальні дози для тварин дослідної групи розраховували з урахуванням маси тіла кожної з особин в день введення. В якості розчинника застосовували фізіологічний розчин натрію хлориду (Натрію хлорид, розчин для інфузій 0,9% в ампулах, виробництва ЗАТ «Інфузія», Україна).

Тваринам контрольної групи вводили фізіологічний розчин хлориду натрію у відповідному об’ємі.

Під час виконання роботи були використані такі аналізатори:

1. ГАМК-рецепторів – коразол (100 мг/кг) [248], тіосемікарбазид (20 мг/кг) [249], пікротоксин (6 мг/кг) [250], бікукулін (20 мг/кг) [251];

2. гліцинових рецепторів – стрихнін (1,5 мг/кг) [252];

3. глутаматних рецепторів – каїнова кислота (30 мг/кг) [244];

4. лібератора серотоніну із пресинаптичного депо – резерпін (15 мг/кг) [253] (всі вказані речовини виробництва фірми «Sigma», США).

Емульгатор – Твін-80, виробництво «Merck», Німеччина.

Аналізатори вводилися в/ч, через 1 год після введення антиконвульсантів нетолерантним та толерантним до дії протисудомних засобів тваринам. Виняток становив тіосемікарбазид, який вводився одночасно з протиепілептичними препаратами [247, 254].

2.3 Експериментальні моделі судомних станів
Для експериментальних досліджень були використані декілька моделей епілепсії, на різних видах тварин, відповідно до методичних рекомендацій ДФЦ МОЗ України – максимальний електрошок (МЕШ), пентилентетразолові (коразолові) конвульсії, тіосемікарбазидні судоми [248, 254, 255, 256].

Інтенсивність судомного нападу оцінювали за допомогою 5-бальної шкали, узявши за основу наступні критерії (враховуючи кількість тварин, що загинули) [257]:

0 – відсутність судомної активності;

1 – тремор голови, судомні здригання, стрибки;

2 – клонічні судоми передніх лап з підйомом на задні лапи;

3 – виражені тоніко-клонічні судоми, падіння тварини на бік, присутня

фаза тонічної екстензії задніх кінцівок;

4 – повторні клоніко-тонічні судоми, загибель тварини.

Враховували також латентний період розвитку перших судомних проявів (посмикування, стрибки), кількість тварин, у яких розвивався розгорнутий клоніко-тонічний напад, летальність. Протисудомним впливом уважали захист тварин від розвитку клонічних, тонічних судом, летальності.

Ефект препаратів оцінювали за їх здатністю:

- попереджувати виникнення симптому Штраубе,

- попереджувати розвиток клонічних судом,

- попереджувати розвиток клоніко-тонічних судом,

- усувати летальність.
2.3.1 Електроіндуковані судоми
Максимальний електрошоковий тест (МЕШ) використовують для оцінки здатності препарату запобігати розповсюдженню великого судомного нападу [255, 258, 259]. Електричний шок, проходячи дифузно через мозок, вибірково впливає на структури з найменшим порогом (гіпокамп, лімбічна система, гіпоталамус). Вважається, що властивість препарату попереджувати максимальні судоми при проведенні електрошоку пов’язане з його властивістю попереджувати поширення імпульсу по нервовій тканині [250].

Максимальний електрошок викликали за допомогою вушних електродів, використовуючи надпорогове подразнення постійним струмом (50 Гц, сила струму 50 мА), тривалістю 0,2 секунди. Електричні стимули подавали за допомогою електростимулятора «ИСЭ-1». Безпосередньо перед накладенням зажимів з електродами вушні раковини тварини протирали фізіологічним розчином для забезпечення максимальної електропровідності. Після цього подавали струм. Оцінювали кількість мишей з тонічними судомами і тривалість судом. Критерієм протисудомної активності сполуки вважали повний захист від тоніко-екстензорної фази судомного нападу у тварин [255, 260].
2.3.2 Хемоконвульсантні моделі судом
В експерименті генерацію судомних розрядів можна викликати або гіперактивацією збуджуючих медіаторів, або зниженням активності гальмівних нейротрансмітерів. Саме тому для моделювання еквівалентів епілепсії з метою вивчення нейромедіаторних механізмів формування толерантності були використані селективні антагоністи гальмівних механізмів мозку (ГАМК, гліцин) і агоністи збудливих систем (глутамат) [131, 247, 255].

ГАМК проявляє сильний інгібуючий вплив на збудливість головного мозку за рахунок підвищення проникності хлорних каналів. В той же час антагоністи ГАМК-рецепторів – коразол, бікукулін – є потужними судомними агентами. Зокрема, коразолові судоми обумовлені зміною ГАМК-бензодіазепінового рецепторного комплексу, бікукулінові – з антагонізмом β-субодиниці ГАМК_А-рецепторів. Інгібітор синтезу ГАМК – тіосемікарбазид – також є сильним судомним ядом.

Гострий напад клоніко-тонічних судом моделювали на мишах шляхом одноразової в/ч ін’єкції аналізатора. Коразол вводили в дозі 100 мг/кг (доза залежить від чутливості експериментальних тварин), бікукулін – 20 мг/кг. Загальний період спостереження за тваринами становив 1 год після ін’єкції аналізатора з реєстрацією основного показника – перших генералізованих клонічних судом з втратою рефлексу перевертання [248, 260]. Наступна оцінка стану тварин проводилася через 24 год.

У дослідних групах вказані аналізатори вводили через 60 хв після введення протиепілептичних препаратів (ПЕП), за винятком тіосемікарбазиду.

Блокатор синтезу ГАМК – тіосемікарбазид (20 мг/кг) використовували для зниження активності ГАМК-ергічної системи. Досліджувані ПЕП вводили одночасно з аналізатором, оскільки судоми виникали через 60-80 хв після введення конвульсанта. Враховували відсоток тварин з клонічними, тонічними судомами та летальність. Загальний термін спостереження за тваринами тривав 2 год.

Амінокислота гліцин – головний гальмівний нейротрансмітер у вертебральній ЦНС. Інгібуюча дія гліцину блокується алкалоїдом стрихніном, що викликає активацію рухових нейронів та призводить до підвищеної збудливості і судом.

При введенні мишам стрихніну (1,5 мг/кг) реєстрували симптом Штраубе та клоніко-тонічні судоми.

Глутаматергічна система підвищує збудливість центральної нервової системи. Саме тому агоніст глутаматних рецепторів каїнова кислота (30 мг/кг) викликає розвиток судомних пароксизмів.

Для дослідження участі серотонінергічної системи у протисудомній активності антиконвульсантів застосовували резерпінову пробу [261]. Дію резерпіну (15 мг/кг) оцінювали за наступними клінічними проявами:

1) своєрідною позою «горб» з вигнутою догори спиною;

2) пілоерекцією.
2.4 Дослідження толерантності сполук
Дослідження розвитку терапевтичної резистентності до основних протиепілептичних препаратів: фенобарбіталу, карбамазепіну, вальпроату натрію, ламотриджину, топірамату проводили на білих мишах [28, 254]. Тварини були поділені на групи. Контрольним мишам в/ч вводили фізіологічний розчин, що дорівнював за кількістю об’єму, введеному піддослідним тваринам. Піддослідним тваринам вводили в/ч досліджуваний препарат протягом 7-14 та 21 діб 1 раз на добу в дозі 10% від ЛД₅₀. Тестування проводили на 3-ю, 5-у, 7-у та 8-у добу для фенобарбіталу, для решти антиконвульсантів – на 3-ю, 5-у, 7-у, 8-у, 10-у, 12-у, 15-у добу за допомогою різних хемоконвульсантів та МЕШ. В результаті було встановлено, що через 7 діб (фенобарбітал) та 14 діб (решта ПЕП) щоденного введення антиконвульсантів спостерігалася редукція їх антикоразолової дії, тобто формувалася толерантність до протисудомного впливу препаратів.

Дослідження протисудомної активності фенобарбіталу (20 мг/кг) проводили за допомогою коразолу (100 мг/кг), тіосемікарбазиду (20 мг/кг) та МЕШ. На введення карбамазепіну в дозі 125 мг/кг тестування проводили за допомогою аналізаторів – тіосемікарбазиду в дозі 20 мг/кг та коразолу в дозі 100 мг/кг, а також МЕШ. На введення вальпроату натрію в дозі 155 мг/кг аналізатором тестування був коразол (100 мг/кг). Тіосемікарбазид, як аналізатор в дозі 20 мг/кг, в/ч, використовували для дослідження антиконвульсивної активності топірамату (300 мг/кг). Протисудомну дію ламотриджину (30 мг/кг) досліджували за допомогою МЕШ [109].
2.5 Вивчення перехресної толерантності між протисудомними засобами
Дослідження перехресної толерантності до протисудомної дії фенобарбіталу, карбамазепіну, вальпроату натрію, ламотриджину, топірамату проводили на білих мишах при застосуванні аналізаторів коразолу, тіосемікарбазиду, а також МЕШ [254].

Феномен перехресної толерантності реєструвався в тому випадку, коли протисудомний ефект препарату не відтворювався при його введенні на фоні толерантності до іншого антиконвульсанта. Критерієм оцінки появи перехресної толерантності на препарат вважали відсутність захисту тварини від нападу клонічних, тонічних судом та летальності.

Розвиток перехресної толерантності до топірамату вивчали у тварин, толерантних до фенобарбіталу та карбамазепіну, на моделі тіосемікарбазидних судом; до карбамазепіну – у тварин, толерантних до фенобарбіталу та топірамату, на моделях коразолових та тіосемікарбазидних судом; до вальпроату натрію – у тварин, толерантних до фенобарбіталу, на моделі коразолових судом; до ламотриджину та карбамазепіну – у тварин, толерантних до фенобарбіталу, на моделі електроіндукованих судом (МЕШ).
Фармакокінетичні механізми розвитку толерантності досліджувалися за показниками зміни рівня досліджуваних антиконвульсантів у крові та мозку толерантних тварин і функціонуванню системи цитохрома Р-450.
2.6 Кількісне визначення антиконвульсантів у сироватці крові та тканинах мозку з використанням методу ВЕРХ
Для проведення хроматографічних досліджень були використані наступні субстанції та реактиви:

1. Карбамазепін (субстанція виробництва «Jubilant Organosys Limited»).

2. Валдісовал – суміш кислоти вальпроєвої та вальпроату натрію у молярному співвідношенні 1 : 2 (субстанція виробництва «Ketwijk Chemie bv» Нідерланди).

3. Ламотриджин (субстанція виробництва «Chemagis ltd»).

4. Топірамат (субстанція виробництва «Alkaloida chemical»).

5. Фенобарбітал (субстанція виробництва ТОВ «Харківське фармацевтичне підприємство «Здоров’я народу»).

6. Метанол для HPLC, 99,9% («Sigma», США).

7. Мурашина кислота, 99,9% («Sigma», США).

8. Ацетонітрил для HPLC, 99,9% («Sigma», США).

9. Ізопропіловий спирт для HPLC, 99,9% («Sigma», США).

Деіонізована вода приготовлена за допомогою системи « Milli-Q», США.

Забір матеріалу (кров і мозок) проводився через 1 год після введення антиконвульсантів у щурів, які знаходилися під ефірним наркозом. Експозиція в 1 год була вибрана у зв’язку з тим, що у цей строк після введення препаратів спостерігається пік протисудомної активності вказаних препаратів в експерименті на щурах при моделюванні хемоконвульсантних судом (коразол, 100 мг/кг, в/ч).

Тому можна припустити, що саме в цей термін формується оптимальний розподіл кількості антиконвульсантів (кров/мозок) для прояву їх протисудомної активності.

Кожна серія дослідів включала дві групи тварин:

1 – нетолерантні тварини, яким одноразово вводили антиконвульсант,

2 – тварини, у яких попередньо формувалася толерантність до досліджуваного антиконвульсанта.

Відбирали головний мозок та кров для приготування біопроб з метою хроматографування. Зразки крові після забору центрифугували для відділення сироватки (центрифуга „ОПН-8”). Тканину головного мозку гомогенізували (гомогенізатор скло/скло). Витяг активної субстанції з сироватки (головного мозку) здійснювали наступним чином: в пробірку типу «епендорф» вносили 0,8 мл сироватки крові (0,5-1 г головного мозку), додавали 2 мл метанолу. Суміш перемішували, ставили в ультразвукову баню (Transsonic 460/H Elma) на 5 хв при температурі 55 ºС для повного осадження білків, охолоджували до кімнатної температури, потім центрифугували (15 хв, 8 тис. об/хв). Відділяли прозорий розчин, заміряли його точний об’єм та переносили у скляну віалу. Потім проводили хроматографування [262].

Концентрацію активної субстанції препаратів визначали методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) за допомогою хроматографічної системи Agilent Technologies 1200 LC/MS system (США) з ультрафіолетовим і мас-спектрометричним детектором. Детектування здійснювали одноквадрупольним мас-спектрометром з електроспрей іонізацією [262, 263, 264, 265].

Хроматографічні вимірювання проводили в ізократичному режимі за допомогою двох аналітичних колонок, з’єднаних послідовно, Rapid Resolution HT Cartrige 4,6 x 30 mm, 1,8 μm та Zorbax SB-C18 4,6x50 mm, 1,8 μm.

Валідацію методики хроматографічного визначення антиконвульсантів проводили згідно з міжнародними настановами та національними правилами проведення біоаналітичних досліджень [266, 267, 268, 269, 270].
2.7 Методика змін барбітуратного сну як показника стану системи цитохрома Р-450
Для з’ясування участі системи ізоферментів Р-450 у механізмі розвитку толерантності до досліджуваних ПЕП застосовували барбітуратний (гексеналовий) сон. Ідеологія цього підходу заключається в тому, що барбітурати (зокрема, гексенал) метаболізується за участю ферментів системи цитохрому Р-450. Тому зниження або підвищення активності цих ферментів відображається на тривалості сну, що дає можливість стверджувати про індукцію або інгібування Р-450 при дії досліджуваного препарата. Гексенал розчиняли в підігрітому (до 40 ºС) фізіологічному розчині з розрахунку 1 г гексеналу в 10 см³ води (10% розчин).

Мишам контрольної групи вводили фізіологічний розчин хлориду натрію (0,9%), дослідної – антиконвульсанти. Через 30 хв всім тваринам в/ч вводили гексенал у дозі 100 мг/кг. Безпосередньо після ін’єкції тварину переносили до прозорої камери та розпочинали візуальне спостереження за перебігом поведінкових реакцій, тобто фіксували латентний період засинання і тривалість сну. Дані показники реєстрували за боковим положенням, або втратою тваринами рефлексу перевертання (тварини залишаються в незручній позі на спині чи на боці) [260, 271].
2.8 Методи статистичної обробки отриманих результатів
Статистична обробка даних наукових досліджень проводилася з використанням програми Statistica 6.0. Математична обробка включала розрахунок середньої арифметичної для групи тварин (М), стандартну помилку середньої (m).

Перед застосуванням статистичних критеріїв проводилася перевірка гіпотези про нормальний закон розподілу випадкових величин за допомогою тесту Шапіро-Уілка та рівності дисперсій (критерій Лівена) [272].

Достовірність різниці середніх значень оцінювалась з використанням t-критерію Ст’юдента. Відмінності вважали статистично достовірними при р<0,05 [273, 274].

РОЗДІЛ 3
РОЗВИТОК ТОЛЕРАНТНОСТІ ДО ПРОТИСУДОМНОЇ ДІЇ

АНТИКОНВУЛЬСАНТІВ ПРИ ЇХ ТРИВАЛОМУ ВВЕДЕННІ
Лікування епілепсії зводиться, головним чином, до призначення антиконвульсантів, прийом яких продовжується роками, а інколи протягом всього життя.

Тривале введення ксенобіотиків, до яких, у тому числі, відносяться і протисудомні препарати, є передумовою можливого розвитку толерантності до їх дії.

Тому виправданим було дослідження особливостей і закономірностей формування толерантності до дії різних протисудомних засобів при їх тривалому введенні, що важливо для визначення тактики і стратегії фармакотерапії епілепсії.

Проведення досліджень в цьому напрямку включало ряд етапів. Спочатку проводилися апробація, верифікація відомих методів експериментальних моделей хемоконвульсантних і електроіндукованих (МЕШ) судомних препаратів. При цьому використовувалися дози і шляхи введення хемоконвульсантів, які відтворюють виражені, стабільні судомні стани у більшості в групі експериментальних тварин (80-100%). Потім визначалися найбільш чутливі моделі до протисудомної дії досліджуваних антиконвульсантів.

Отримані результати склали експериментальну базу для дослідження розвитку толерантності до протисудомної дії протиепілептичних препаратів (ПЕП).

Толерантність оцінювалася як сформована, коли після тривалого, щоденного введення препарату припинялася його протисудомна активність.