1 История, основные понятия 8. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители д м. н., профессор Л. В. Чистова д м. н., профессор М. И. Баканов
 Скачать 0.51 Mb.
|
Методы и количество исследованийТаблица № 9
В дальнейшем под влиянием пероксидазы реакция идёт до предшественников конечных продуктов. Интенсивность окраски пропорциональна длине волны отражённого света. Глюкоза определялась также глюкозооксидазным, унифицированным методом, так как трудно получить препарат глюкозооксидазы, полностью свободный от каталазы, роль которой состоит в разрушении образующейся перекиси водорода, поэтому всегда существует угроза получения заниженных результатов. Принцип унифицированного глюкозооксидазного метода по окислению о-толидина заключается в окислении глюкозооксидазой глюкозы с образованием перекиси водорода, которая под действием пероксидазы окисляет ортотолудин с образованием синего хромогена. Результаты регистрировались. Интенсивность окраски прямо пропорциональна содержанию глюкозы. Расчёт глюкозы проводился по калибровочному графику. (16). Метод относится к высокоспецифичным и высокочувствительным, позволяющим определить от 5 мкмоль глюкозы. В клинике гепатологии во время проведения нагрузочной пробы с глюкозой, а также с глюкагоном глюкозу крови определяли с помощью глюкометра фирмы «Джонсон и Джонсон» (USA). Метод позволяет определить уровень сахара непосредственно у постели больного или в процедурном кабинете в течение 1 минуты, что позволяет исключить транспортировку крови в биохимическую лабораторию. ^ Лабораторная диагностика гликогенозов осуществлялась в два этапа. На первом этапе проводили нагрузочные тесты с глюкозой и глюкагоном. Проведение этих нагрузочных тестов позволило выделить гликогенозы из группы заболеваний, сходных по клинической картине. ^ Нагрузочные пробы с а) глюкозой и б) глюкагоном проводились утром, натощак, после 12-14 часов голодания Расчёт глюкозы Таблица №10
Детям в возрасте до 1 года, а также больным с гипогликемическими судорогами в анамнезе - период голодания сокращался до 5-7 часов, т.е. проводился один ночной приём пищи. Глюкоза давалась больному натощак в виде 25-30% водного раствора и рассчитывалась по схеме: Минимальная доза не должна быть меньше 10 г, а максимальная не больше 50г. Капиллярную кровь отбирают натощак, а также через 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180 мин - после приёма сахара. У больных с печёночной формой гликогеновой болезни в ответ на введение глюкозы мы не наблюдали значительного увеличения содержания глюкозы в крови, характерного для больных с сахарным диабетом. В то же время, практически у всех больных с гликогеновой болезнью, отмечалось замедленное снижение концентрации глюкозы в крови. При этом гликемические кривые у больных с III типом гликогеноза имеют многогорбый (двух, трёхгорбый) вид. Уровень лактата в ответ на введение глюкозы незначительно изменялся, за исключением больных гликогенозом I типа, у которых уровень молочной кислоты резко снижался после перорального введения глюкозы. Тощаковый уровень лактата указывал на тяжесть основного заболевания. Нагрузочный тест с глюкагоном. С утра натощак определяли уровень сахара в крови и вводили раствор глюкагона подкожно или в/мышечно детям с массой тела менее 20 кг-20-30 мкг/кг, минимум 0,25, максимум-2мг. Глюкагон в отличие от адреналина не вызывает вазомоторных реакций и не влияет на обмен гликогена в мышцах. После инъекции глюкагона сахар в крови исследовали каждые 20 минут, 6-7 раз подряд. Определяли отношение между самой высокой цифрой и исходным уровнем сахара в крови (индекс Кугельмана). Определение кислотно - щелочного равновесия проводилось в лаборатории функциональной диагностики (руководитель лаборатории д.м.н., профессор Лукина О.Ф.) на аппарате АВL-520. В норме рН плазмы лежит в пределах 7,40-7,44,буферные основания (ВВ) 40-44ммоль/л, избыток оснований (ВЕ) от –0,98 до 3,0 ммоль/л. Метаболические нарушения характеризуются избытком кислот при ацидозе и оснований при метаболическом алкалозе. При гликогеновой болезни во время гипогликемии наблюдается нарушение выведения углекислого газа легкими, вследствие этого происходит учащение дыхания - одышка, в дальнейшем глубокое и редкое дыхание (по типу Куссмауля) как предвестник угрожаемых судорог, приводящих к коматозному состоянию. Избыточная выработка кислых продуктов тканями и нарушение выведения оснований с мочой и другими биологическими жидкостями приводит к хроническому метаболическому ацидозу. Кислотно - основное состояние у 58,9 % пациентов без гипогликемии было в норме и у 24,3% детей (с I и III типами гликогеновой болезни) отмечался компенсированный метаболический ацидоз, который характеризовался нормальными показателями рН крови. и парциального напряжения углекислого газа (р СО =26,0-18,0ммрт. ст.) Выраженный метаболический ацидоз наблюдался у 16 (16,8%)детей с I, III типами гликогеновой болезни. Метод служит маркёром тяжести проявлений метаболических изменений в организме больного с ГБ. Определение концентрации лактата крови проводили колориметрическим методом, на аппарате сухой химии «Vitros-250».Длительность реакции 5 минут, температура 37 С, длина волны 540 нМ. «Vitros Lac» слайд представляет собой аналитический элемент с основанием из полиэстера. Слайд инкубируется и в интенсивно окрашенном комплексе измеряется уровень молочной кислоты, полученный методом спектрофотометрии. Лактат является конечным продуктом анаэробного метаболизма глюкозы и наряду с кетоновыми телами участвует в развитии метаболического ацидоза. Накопление молочной кислоты, помимо нарушений активности состояний соответствующих ферментов, обусловлено также гипоксией тканей. ^ ОСНОВНЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ У ЗДОРОВЫХ ДЕТЕЙ (сводные данные по литературным источникам) 1 Таблица № 11.
^ Определение концентрации холестерина липопротеинов высокой плотности и липопротеинов низкой и очень низкой плотности крови проводилось в лаборатории клинической биохимии ГУ НЦЗД РАМН на аппарате «Vitros-250» старшим научным сотрудником Г.Ф. Гордеевой. ^ Биохимические исследования, включающие определение ряда биохимических параметров крови (билирубина и его фракций, активности АЛТ и АСТ, холестерина, мочевой кислоты, щелочной фосфатазы, электролитов, протеинограммы, и др.) проводили в лаборатории клинической биохимии ГУ НЦЗД РАМН (зав. – проф. М.И. Баканов), на автоматическом биохимическом анализаторе «Синхрон СХ-5 дельта» (фирмы Бекман – Культер (USA)). Нормы основных биохимических показателей приведены в таблице № 7. Инструментальные методы исследования включали ультразвуковое исследование (УЗИ) печени, желчного пузыря, поджелудочной железы, сердца, электро - и эхо - кардиографию, рентгенологическое исследование, денситометрию. Метод УЗИ является безболезненным и высокоинформативным, не требует специальной подготовки больного, может быть проведен независимо от тяжести состояния больного. ^ Ультразвуковое исследование органов брюшной полости, забрюшинного пространства и допплерографию проводили по общепринятой методике в лаборатории ультразвуковой диагностики (зав. – проф. И.В. Дворяковский) ГУ НЦЗД РАМН на аппаратах SSD-680 и SSD-1700 (Aloka, Япония) и «Дженерал электрик- LOGIQ9» с высокочастотным датчиком 3,5-5 Мгц. Выполнялась ультразвуковая оценка печени и кровотока в цветовом и импульсном режимах. Исследование печени включало измерение левой доли (переднее - задний, медиально-латеральный и верхне-нижний размер), правой доли (верхнее - нижний размер). Допплерографическое исследование сосудов портальной системы и чревного ствола проводилось: по воротной вене - в области ствола, по печеночным и селезеночным артериям - в месте их выхода из чревного ствола, по селезеночной вене - в области ворот селезенки, по средней печеночной вене - отступая 2-3 см от места ее впадения в нижнюю полую вену. Основными критериями оценки кровотока являлись показатели объемного кровотока, индекса резистентности по артериям и пульсового индекса по печеночной вене. Эхографическое исследование проводилось на аппаратуре фирмы Acuson SEQUOIA-512. к.м.н -. Сугак А.Б. У детей с I и III типами типом гликогеновой болезни выявлен гидроперикард от 2 до 15мм. ^ Оценка костного возраста проводилась в клинике рентгенологической диагностики и компьютерной рентгенографии (руководитель). Отставание сроков созревания ядер окостенения обнаружено у 30,5%(29) детей с различными типами гликогеновой болезни. Денситометрия проводилась в клинике метаболических болезней и остеопороза ГУ НЦЗД РАМН (руководитель - д.м.н. Чумакова О.В.) методом двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии. Остеопения позвоночника выявлена у двенадцати (48%) обследованных детей с различными типами гликогеновой болезни. МПКТ достоверно не отличалась у мальчиков и девочек. При костной денситометрии выявлено, что у больных с I типом средний уровень Z – критерия соответствовал 1,81,9, у детей с III типом –2,00,9. Оценка гуморального звена иммунитета осуществлялась путём определениея концентрации иммуноголобулинов классов А,G,М, в сыворотке крови, в лаборатории иммунологии и микробиологии (руководитель проф. Ботвиньева В.В.) ГУ НЦЗД РАМН. Исследования иммуноглобулинов проводились методом радиальной иммунодиффузии по Манчини (1965) с использованием моноспецифических антисывороток отечественного производства. Проведённые исследования позволили выявить снижение иммунитета класса IgG, повышение Ig А у больных сI типом гликогеновой болезни. На втором этапе обследования проводили биопсию печени и определяли в них содержание и структуру гликогена, а также активность ферментов, участвующих в обмене гликогена. Такая последовательность позволяет окончательно установить диагноз гликогеновой болезни и тип гликогеноза. Пункционная биопсия печени проводилась в отделении плановой хирургии НЦЗД РАМН ( зав. отделением проф А.И. Лёнюшкин ) д.м.н. Сеняковичем В.М. Пункционная биопсия печени проводилась под общим наркозом с помощью игл Сильвермана. Ткань печени, полученную при биопсии помещали в пластмассовую пробирку, затем замораживали при – 78 С с помощью сухого льда. Результаты проведённой биопсии печени (n -45) Рисунок № 2  Для определения содержания гликогена и активности ферментов гомогенат печени готовился непосредственно перед исследованием (1% гомогенат печени на дистиллированной воде). Вследствие быстрой инактивации некоторых ферментов повторное замораживание и использование ткани печени не допустимо. Биопсия печени проведена у 45 пациентов. Полученные данные представлены в табл. №8, 9 Определение концентрации гликогена печени выполнялось с помощьюферментативного гидролиза, путём оценки количества образовавшейся глюкозы с помощью глюкозооксидазного метода. К 0,1мл раствора добавляли 0,2 мл 0,2 М ацетатного буфера ( рН 4,8), содержащего 5мг/мл ферментного препарата амилоглюкозидазы, полностью превращающей гликоген в глюкозу. Объём смеси доводили до 1мл дистиллированной водой, инкубировали в течение 3ч при 30С и определяли количество образовавщейся глюкозы. Содержание гликогена в пробе равнялось количеству глюкозы, умноженному на коэффициент 0,93.Концентрация гликогена определена у 14 детей. Рисунок № 3  Определениеструктуры гликогена проводилось методом спектрофотометрии (Krisman 1962 г). Метод Крисман основан на получении разных спектров поглощения комплекса полисахарида с йодом и определении максимума поглощения, в зависимости от структуры исследуемого полисахарида. Максимум поглощения комплекса йода с гликогеном соответствует 410-460 нм, с лимит - декстрином-390 нм, с амилопектином-540 нм. Структура гликогена определена у 9 детей. Определение активности глюкозо-6- фосфатазы печени основывалось на измерении количества неорганического фосфора, образующегося при распаде глюкозо-6-фосфата в присутствии гомогената печени. Для учёта действия неспецифических фосфатаз исследовались опытная и контрольная группа. Специфическая фосфатаза инактивируется в кислой среде, поэтому в контрольной пробе к 0,1 % гомогенату ткани добавляли 0,01 мл 0,1 М ацетатного буфера (рН 5,0) и инкубировали 5мин при 37С, затем к смеси добавляли субстрат и инкубировали 60мин. В опытной пробе к 0,2 мл гомогената ткани прибавляли 0,02 мл субстрата смеси, содержащее 0,1 М динатриевой соли глюкозо- 6- фосфата, 2мМ ЭДТА рН 6,5.Такое же количество субстрата добавляли и в контрольную пробу. Затем обе пробы инкубировали 60мин, при 37С. После окончания инкубации опытных и контрольных проб определяют в них количество образовавшегося неорганического фосфора по методу Фиске - Суббароу и расчитывают активность специфической глюкозо- 6- фосфатазы, выражая её в микромолях фосфата, образованного за 1мин. В печени человека активность глюкозо- 6 фосфатазы в норме составляет 4-13 ед. Определение активности амило- 1,6- глюкозидазы основано на способности фермента расщеплять -1,6глюкозидазные связи в фосфорилазном лимит- декстрине с образованием глюкозы. К 0,05 мл гомогената печени добавляли 0,05мл смеси, содержащей 2% фосфорилазного лимит- декстрина, 5 мМ ЭДТА, растворённого в 0,1М гистидинового буфера рН 6,5, затем проводили инкубирование в течение 120мин, при Т 37С. Контрольные пробы не инкубировали. Реакцию останавливали добавлением равных по 0,05мл объёмов 0,15М раствора Ва (ОН)2 и 0,15 М раствора ZnSO4, центрифугировали и в надосадочной жидкости определяли количество образовавшейся глюкозы с помощью глюкозооксидазного метода. Активность фосфорилазы «а» основано на способности фермента освобождать неорганический фосфат из глюкозо-1- фосфата в присутствии или отсутствии АМФ. Субстратная смесь содержит 0,1 М глюкозо-1-фосфат, 2% гликоген, 0,03 М АМФ и 0,2 М NаF (pH 6,1). К 0,05 мл субстратной смеси добавляют 0,05 мл гомогената ткани и инкубируют при 37 С в течение 0, 10, 20, 40 мин. После окончания к пробам добавляют 0,5мл 10% раствора ТХУ и 3,7 мл ледяной дистиллированной воды. Выпавшие в осадок белки удаляют центрифугированием, а в надосадочной жидкости определяют количество образовавшегося неорганического фосфора по методу Фиске - Суббароу. Через 10мин определяют оптическую плотность раствора при 620 нм и рассчитывают количество неорганического фосфора. Количество неорганического фосфата пропорционально времени инкубации и количеству фермента. Активность фермента выражают в единицах, соответствующих микромолям фосфора, освобождаемого за 1 мин 1 г ткани. Для печени в норме эти величины составляют от 15 до 55 ед, а для мышц- от 60 до 140 ед. Биохимическое определение олигосахаридов проводилось в МГНЦ ЗД РАМН в лаборатории наследственных болезней обмена веществ. Метод комбинированной газовой хроматографии и mass- спектрометрии позволяет выявить патологическую экскрецию глюкотетрасахаридов у больных с II и VI типами гликогеновой болезни.(Palo u Savolainen 1972,Friedman 1978, Scwell 1979, Tsai, Morschal,1979). Исследование проведено у 38 % детей, наблюдающихся в ГУ НЦЗД РАМН. Были обследованы 25% пациентов дефицитом фосфорилазной системы У всех 25% обследованных пациентов с дефицитом фосфорилазной системы обнаружена гиперэкскреция олигосахаридов. Экскреция мочевой кислоты в суточной моче исследовалась в лаборатории клинической биохимии ГУ НЦЗД РАМН. Высокая экскреция выявлена у 26 (27,3 %) детей.50% составили дети с VI типом ГБ, 26,9%-дети с I типом, 23%- дети с III типом гликогеновой болезни. ^ Статистический анализ Обработку полученных данных проводили методами математической статистики с расчетом среднего арифметического значения (М) и стандартного отклонения (d). Достоверность различий между количественными показателями вычисляли с использованием критерия Стьюдента, результаты считали статистически достоверными при р<0,05. Для установления связи между изучаемыми параметрами применяли корреляционный анализ. Для сравнительной характеристики использован пакет «Statsoft Statistica 6.0». |