УЧЕБНИКгенетика. Генетика изучает процессы преемственности жизни на молекулярном, клеточном, организменном и популяционном уровнях
 Скачать 6.93 Mb.
|
|
Глава 13 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ГЕНЕТИКИ ЧЕЛОВЕКА Основные генетические законы и закономерности имеют универсальное значение и в полной мере приложимы к человеку. Человек как объект генетических исследований имеет ряд особенностей. Как у объекта исследования у него есть свои достоинства и свои трудности. Трудности: большое число хромосом в кариотипе человека (2п=46); продолжительность цикла развития до наступления половозрелости, человек — одноплодная особь (за одну беременность, как правило, рождается один ребенок), исключение — рождение близнецов; малое количество детей в браке (обычно, один ребенок); невозможно формировать необходимую схему брака, так как люди свободно скрещиваются (в основе браков лежат любые мотивы, кроме научно-исследовательских целей). Однако исчерпывающие знания по анатомии и физиологии человека (т.к. начиная со времен Галена и Гарвея по настоящее время велись эти исследования), большое число мутаций, пополняемых и в настоящее время, многочисленность человеческой популяции в целом позволяют всегда выбрать нужную схему брака. Для человека характерны все известные в генетике типы наследования признаков: доминантный, кодоминантный, рецессивный, аутосомный и сцепленный с половыми хромосомами, ограниченный полом и др. Большую работу по систематизации сведений о наследственных признаках человека проводит Мак-Кьюсик, который на протяжении последних десятилетий суммирует все данные мировой литературы по этому вопросу и публикует их в виде каталога менделирующих признаков у человека. Типы наследования и формы проявления генетических задатков у человека весьма многообразны, и для дифференциации между ними требуются специальные методы анализа, в первую очередь, клинико-генеалогический анализ. 13.1. Клинико-генеалогический метод Основой метода является составление родословной и ее последующий анализ. Впервые был предложен Ф.Гальтоном в 1865 году. Задачами метода являются установление наследственного характера признака и определение типа наследования. Вместе с тем этот метод дает возможность изучать сцепленное наследование, определять тип взаимодействия генов и пенетрант-ность аллелей. Он лежит в основе медико-генетического консультирования. Метод широко применяется дл"я решения ряда научных и прикладных задач генетики. 13.1.1. Современные аспекты клинико- генеахогического метода Клинико-генеалогический метод используется для диагностики наследственных болезней и медико-генетического консультирования, а также позволяет изучать гетерогенность наследственных болезней. С.Н. Давиденков применял клинико-генеалогический метод при изучении генетической гетерогенности и клинического полиморфизма нервных болезней. Позже такие исследования проводились с помощью анализа семейных данных (Н.Бочков, 1978). Кроме того, клинико-генеалогический метод позволяет осуществлять генетическую профилактику (предупреждение рождения больного ребенка), а также раннюю профилактику клинических проявлений наследственных болезней. Для доказательства наследственного характера патологии применяются как анализ отдельных обширных родословных, так и статистическая обработка подобранных по определенному признаку сведений о семьях. Существует ряд признаков, свидетельствующих о наследственной природе некоторых болезней: «семейный» характер проявления болезни; семейное накопление; увеличение числа больных среди родственников пробанда по сравнению с частотой данного заболевания в популяции; увеличение конкордантности монозиготных близнецов по сравнению с дизиготными; а также выявление рецессивных патологий в семьях кровнородственных браков. Клинико-генеалогический анализ начинается с составления родословной. 13.12» Составление родословной Сбор семейных сведений Сбор сведений о семье начинается с человека, называемого пробандом. Для сбора сведений используют разные формы анкетирования в сочетании с обследованием членов семьи. Основными труд ностями. при сборе материала является некоторая субъективность получаемой информации, недостаточность ее объема, а также возможные искажения. Трудности такого рода связаны с недостаточной информированностью о здоровье близких и дальних родственников. Чем больше родственников будет опрошено, тем достовернее и полнее будут полученные сведения. Во многих случаях, несмотря на ряд специальных приемов, не удается выяснить подробности обо всех членах семьи, в силу объективных причин — неверно поставленный диагноз и субъективных — когда скрываются некоторые сведения о семье мужа или жены из-за боязни расторжения брака или по другим причинам, например, когда возникает неосознанное желание переложить вину за наследственное заболевание ребенка (особенно таких, как нарушение психики, интеллекта, врожденные уродства и т.д.). В связи с этим желательно одновременно собирать анамнез жизни и болезни у самого пробанда и его родственников. Опрос необходимо проводить с каждым из супругов отдельно, соблюдая конфиденциальность беседы, во время беседы необходимо быть внимательным и соблюдать чувство такта. Необходимо обратить внимание на все болезни и любые патологические симптомы. Метод анкетирования может быть использован самостоятельно или дополнять метод беседы. Иногда используются выписки из истории болезни, справки лечебных учреждений, результаты анализов, заключение консультантов и т.д. Порядок получения сведений при опросе: обычно пробанд и его родственники могут дать сведения о трех поколениях: родители, дети, внуки. Желательно получить сведения о максимальном количестве родственников как по «горизонтали», так и по «вертикали». Начинают опрос обычно с родственников по материнской линии: бабушка и дедушка по матери, их дети по порядку рождения, с указанием внуков, детей каждого ребенка бабушки и дедушки. В родословную необходимо вносить сведения о выкидышах, абортах, мертворожденных, бесплодных браках и т.д. Затем, в такой же последовательности, собираются сведения о родственниках отца пробанда. Регистрируют следующие сведения: • фамилия, имя, отчество. Для женщины указывают девичью фамилию; • возраст, для живых год — рождения, а для умерших — возраст, в котором наступила смерть, иногда указывают дату рождения и дату смерти; • национальность; • место жительства семьи (для учета возможных эндемичных факторов), место жительства предков; • профессия; • наличие хронических заболеваний у родственников, для умерших родственников указывается причина смерти, в том числе и насильственная; • адреса родственников с подробными паспортными данными. Объем обследования, количество родственников и регистрация полученного материала зависят от цели составления родословной. Графическое изображение родословной По завершении сбора сведений приступают к графическому изображению родословной. Для этой цели разработана система условных обозначений (рис.13.1). При составлении родословной пользуются стандартными символами Поколения в родословной обозначаются римскими цифрами, которые ставятся слева от родословной. Арабскими цифрами нумеруется потомство одного поколения слева направо. Братья и сестры располагаются в порядке рождения и именуются сибсы.  Заболевание (признак) обозначается вольно и записывается в легенде. Оно (он) может обозначаться буквой или затушевываться, особо отмечаются возможные носители патологии, а также случаи неполного проявления заболевания (кондукторы). Для живых регистрируют год рождения, для умерших — возраст, в котором наступила смерть. Если сведений нет, то ставится знак вопроса. В легенде необходимо оговаривать характер сведений, степень их достоверности. Изображение родословной необходимо начинать с самого старшего поколения. Хотя многие авторы рекомендуют начинать от пробанда. Допускаются различные способы графического изображения родословных: расположение по окружности определенного радиуса или вертикально-горизонтальное изображение. При составлении родословной необходимо соблюдать следующие правила:
или одном радиусе. Сибсы располагаются слева направо. 3. При объединении линии матери и отца могут изображаться ниже линии родственников; если они здоровы и не влияют на данное заболевание, могут вообще не регистрироваться в родословных. 4. Супруги родственников пробанда могут изображаться ниже линии родственников, если они здоровы и не влияют на данное заболевание, могут вообще не регистрироваться в родословных. 5. В случае, когда в семье несколько наследственных заболеваний, не связанных между собой, желательно остановить свой выбор на одном. 13.1.3. Анализ родословной Анализ родословной включает в себя следующие этапы: 1. Установление, является ли данный признак наследственным. Является ли данный признак единичным или в семье имеется несколько случаев (семейный характер). Если признак в родословной встречается несколько раз в разных поколениях, то можно предполагать, что этот признак имеет наследственную природу. 2. Определение типа наследования признака. Для этого тщательно анализируют родословную, обращая внимание на следующие моменты: • встречается ли изучаемый признак во всех поколениях; • многие ли члены родословной обладают этим признаком; • одинакова ли частота у лиц обоих полов; • у лиц какого пола он встречается чаще;
• есть ли в родословной семьи, где у обоих здоровых родителей рождались больные дети; • есть ли в родословной семьи, где у обоих больных родителей рождались здоровые дети; • какая часть потомства имеет наследуемый признак в семьях, где болен один из родителей.
 Характерные черты аутосомно-рецессивного наследования: признак встречается в родословной редко, не во всех поколениях, с одинаковой частотой у мальчиков и девочек. Признак может проявиться у детей, родители которых им не обладали. Если признак имеет один из родителей, то он может совсем не проявиться у детей или проявиться у половины. Характерные черты наследования, сцепленного с полом: Х-доминантное наследование. Признак встречается чаще у лиц женского пола. Если мать больна, а отец здоров, то передача патологического признака происходит вне зависимости от пола. Если болен отец, а мать здорова, то все дочери унаследуют от отца патологический признак. Все сыновья будут здоровы (крисс-кросс наследование) (рис. 13.4).  Х-рецессивное наследование. Признак (заболевание) встречается чаще у лиц мужского пола. Характерен «перескок» признака через поколение. В семьях, где рба родителя здоровы, могут рождаться 50% больных сыновей (если мать гетерозиготна). Лица женского пола, обладающие патологическим признаком, могут рождаться только в семьях, где отец болен, а мать гетерозиготна (рис. 13.5). У-сцепленное наследование. Признак встречается только у лиц мужского пола. Признак передается по мужской линии всем сыновьям (при полной пенетрантности), это голандрический тип наследования. Характерные черты цитоплазматического наследования. Признак (заболевание) встречается с одинаковой частотой у обоих полов; признак передается потомкам от матери; больная мать передает признак либо всему потомству, либо только его части в зависимости от попадания в зиготу аномальных плазмогенов от яйцеклетки. (Пример — одна из форм несращения остистых отростков позвонков.)    Задача 3. Составьте родословную и определите тип наследования одной из форм глаукомы по данным анамнеза. Пробанд (мужчина) страдает глаукомой. Его два брата и две сестры, а также родители, сестра матери и трое из четырех братьев матери здоровы. Три сына и две дочери больного брата матери пробанда здоровы. Бабка пробанда со стороны матери и ее две сестры здоровы. Брат бабки болен. Из шести сыновей одной из сестер бабки двое больны. Вторая сестра бабки имеет трех больных сыновей из четырех. Ее четыре дочери здоровы, и две из них имеют здоровых детей: одна — двух дочерей и одного сына, вторая — одного сына. Больной брат бабки имеет двух здоровых дочерей, одна из которых бездетна, трех здоровых внучек и одного здорового внука. Один его внук болен. Родители бабки пробанда здоровы, но мать бабки имеет двух больных братьев. Родители прабабки пробанда здоровы. Задача 4. Арахнодактилия (паучьи пальцы) наследуется как доминантный аутосомный признак с пенетрантностью, равной 30%. Леворукость — рецессивный аутосомный признак с полной пенетрантностью. Определите вероятность рождения ребенка с двумя аномалиями в семье, в которой оба родителя гетерозиготны по обеим парам генов. Задача 5. Подагра является доминантным ауто-сомным признаком. По некоторым данным пенетрантность этого гена у мужчин составляет 20%, а у женщин она равна нулю. Какова вероятность заболевания подагрой в семье гетерозиготных родителей? Какова вероятность заболевания подагрой в семье, где один из родителей, гетерозиготен, а другой нормален по анализируемому признаку? Задача 6. По данным шведских генетиков некоторые формы шизофрении наследуются как доминантные аутосомные признаки. При этом у гомозигот пенетрантность равна 100%, а у гетерозигот 20%. Определите вероятность рождения больных детей в семье, где один из супругов гетерозиготен, а другой нормален в отношении анализируемого признака. Задача 7. Полидактилия наследуется как ауто-сомно-доминантный признак. Проследите наследование этого признака в семье и подумайте, как можно объяснить наличие разного количества пальцев на руках и ногах у носителей признака. Цифрами на схеме родословной обозначено количество пальцев на руках и ногах у страдающих полидактилией субъектов.  Задача 8. Напишите генотипы всех персон и укажите тип наследования пигментной ксеродер-мы согласно следующей родословной, где это заболевание проявилось в единичном случае в браке двоюродных сибсов.  13.2. Цитогенетический метод Основным объектом цитогенетического метода являются субклеточные структуры, главным образом, хромосомы. В настоящее время разработаны методы для исследования молекулярных механизмов структурной организации хромосом, особенностей их функционирования в процессе жизнедеятельности, а также закономерностей изменчивости и их стабильности. Изучение хромосом человека прошло три основных этапа. Первый этап — поиск адекватных методических путей изучения морфологии хромосом, связан с именами таких биологов, как М.С. Нава-Шин, П.И. Живаго, А.Г. Андерс, Г.К- Хрущев. Второй этап — опубликование первой работы (J.Tjio, A.Levan, 1956), в которой удалось получить картину морфологии хромосом человека и точно идентифицировать их число. Началось активное изучение морфологии митотических и мейотических хромосом в норме и после воздействия мутагенов различной природы (А.А. Прокофьева-Бельговская, 1969, E.Ford 1973). В 1959 г. Л ежен открыл хромосомную природу синдрома Дауна, а в течение последующих лет были описаны и другие, наиболее часто встречающиеся хромосомные болезни. Было показано, что значительная часть детей с пороками развития имеет хромосомные аномалии. Цитогенетика стала важной областью практической медицины. Третий этап — начинается с разработки методов дифференциального окрашивания хромосом (B.Dutrillaux, 1975; А.Ф. Захаров, 1977). Эти методы позволили идентифицировать каждую хромосому человека, составить для них цитологическую карту линейной неоднородности. В последние годы разработаны ДНК-зонды, с помощью которых можно оценить наличие или отсутствие определенного, даже очень маленького, сегмента в хромосоме (см.раздел 4.4). Изучение строения и функционирования хромосом человека имеет большое теоретическое и практическое значение для медицинской генетики. Знание того, что собой представляет каждая хромосома человека в химическом, цитологическом и генетическом отношении, важно для правильного понимания происхождения хромосомных нарушений и обусловленных ими отклонений. 13.2.1. Методы анализа хромосом Хромосомные болезни клиницисты стали изучать еще до установления точного числа хромосом человека. Например, синдромы Клайнфельтера и Шерешевского — Тернера были описаны до открытия хромосомной этиологии этого синдрома. В настоящее время для выявления наследственной патологии используют метод оценки хромосомных аберраций в лимфоцитах человека (см.раздел 12.2.3). Препараты хромосом человека можно приготовить из любой пролиферативно активной ткани (костного мозга, собственно соединительной ткани и др.), но чаще для этой цели используют лимфоциты периферической крови. Кровь донора помещают в специальную среду, которая содержит все необходимые для роста клеток крови питательные вещества, и инкубируют в присутствии специальных веществ — митогенов, которые стимулируют лимфоциты к делению. Клетки растут в культуре в течение 72 часов, за это время лимфоциты проходят два митотических деления, после чего добавляют специальное вещество — колхицин. Колхицин ингибирует процесс формирования нитей ах-роматинового веретена, и все делящиеся клетки V останавливаются на стадии метафазы. В метафа-зе хромосомы максимально конденсированы, что позволяет хорошо их различать (см.раздел 4.4). Обнаружение трисомии по 21-й хромосоме при синдроме Дауна Леженом в 1959 г. определило важность цитогенетики в медицине. Цитогенетичес-кая болезнь Дауна представлена двумя вариантами: простым (трисомным) и транслокационным. В основе болезни Дауна лежит нерасхождение по 21-й паре хромосом. Кариотип больного при три-сомном варианте содержит 47 хромосом, при этом лишней оказывается 21-я хромосома. При транслокационном варианте в кариотипе содержится 46 хромосом, причем в наборе имеются две нормальные 21-е хромосомы, одна нормальная 15-я хромосома и крупная аномальная непарная хромосома, представляющая собой соединение 21-й и 15-й хромосом. Другой формой транслокации при болезни Дауна может быть соединение между собой двух 21-х из трех, имеющихся в клетке. Трисомный вариант синдрома Дауна встречается в 95% случаев, на транслокационные формы приходится 4% и на мозаицизм 1% случаев этого синдрома. При мозаичном варианте 46/47 (норма/трисомия) выраженность симптомов зависит от соотношения клеток с генотипом 46 к клеткам с генотипом 47. Синдромы Патау и Эдварса — два других тяжелых заболевания, связанные с аутосомной анеу-плоидией. Синдром Патау возникает при трисомии по хромосоме 13 и встречается примерно у одного из 5000 новорожденных. Наиболее характерные признаки этого заболевания — расщепление губы и неба («заячья губа», «волчья пасть»), микроцефалия, полидактилия; пороки внутренних органов включают — пороки сердца, гипоплазию мозжечка, дивертикулы и др. Синдром Патау встречается в двух цитогенетических вариантах — простая трисомия 13-й хромосомы и транслокация D/13. Синдром Эдварса возникает при трисомии по хромосоме 18. При этом синдроме нарушения нормального развития затрагивают практически все системы органов. Частота синдрома среди новорожденных составляет около 1 на 10000. Среди заболеваний человека, сопровождающихся хромосомными нарушениями, особое место занимают злокачественные образования (см.главу 16). В 1960 г. американскими исследователями П.Ноуэллом и Д.Хангерфордом было обнаружено у больных хроническим миелолейкозом специфическое хромосомное нарушение — деления хромосомы 22 (рис.13.6). В честь города, где было сделано это открытие, делитированная хромосома была названа «филадельфийской» и сокращенно обозначается символом «Ph1». По данным многих авторов, Ph'-хромосома встречается в клетках костного мозга в 80—100% метафаз у большинства больных хроническим миелолейкозом в любой фазе заболевания. Ph'-хромосома присутствует у больных лишь в миелоидных тканях, она очень редко обнаруживается в клетках других тканей — в культуре кожных фибробластов, в культуре лимфоцитов периферической крови. В последние годы разработан метод цитогенетического анализа хромосом сперматозоидов человека. Сперматозоиды — высокодифференцированные клетки (не способные к делению), содержащие гаплоидный набор хромосом. Однако их генетический материал может удваиваться и вступает в митоз после оплодотворения. Для этой цели у самки золотистого хомячка вызывают суперовуляцию (с помощью гормонов), затем отбирают ооциты и соединяют со спермой человека. Сперматозоиды оплодотворяют яйцеклетки хомячка, образуется химера: человек + хомяк. Образовавшаяся зигота начинает делиться, однако эти деления различных видовых организмов несбалансированны, и через несколько часов такая химера погибает. Процесс оплодотворения стимулирует сперматозоиды к делению, и этих первых делений достаточно, чтобы накопилось определенное число митотических клеток.  На приготовленном препарате можно легко различить хромосомы человека и хромосомы золотистого хомячка. Хромосомный анализ сперматозоидов человека проводят с целью оценки генетической стабильности хромосомы, в случаях контакта с мутагенами и для выявления мужского бесплодия. 13.2.2. Половой хроматин Цитогенетический метод позволяет определять половой хроматин. В клетках мужского организма Х-хромосома всегда выполняет активную функцию, у женщин одна Х-хромосома играет важную роль и определяет развитие женского пола, а вторая находится в неактивном, спирализованном состоянии (тельце Барра). Тельце Барра представляет собой маленькую хорошо окрашивающуюся структуру на внутренней поверхности ядерной мембраны соматических клеток женщин (рис. 13.7).  Присутствие Х-хроматина в норме у женщин связано с инактивацией одной из двух Х-хромосом (рис.13.8). При любом числе хромосом в активном состоянии всегда будет только одна, другие будут образовывать тельце Барра. Следовательно, половой хроматин в норме выявляется только у женщин и отсутствует у мужчин. У женщин с кариотипом 47, XXX обнаруживаются два тельца Барра, с кариотипом 48, ХХХХ — три, а с кариотипом 45, ХО — ни одного. У мужчин с кариотипом ХХУ — одно, ХХХУ — два, ХХХХУ — три тельца Барра.  Определение Х-полового хроматина у плода помогает своевременно определить его пол. Это бывает важно для решения вопроса о дальнейшей его судьбе при диагностике наследственных заболеваний, связанных с анеуплоидиями по половым хромосомам. 13.2.3. Лабораторная работа Определение полового хроматина В настоящее время разработан простой и доступный метод получения материала для определения полового хроматина — соскобы слизистой оболочки полости рта. С целью получения соскобов проводится следующая процедура: слегка заостренным (но не острым) металлическим шпателем, который перед каждым соскобом обрабатывается спиртом и протирается стерильной салфеткой, производится соскоб быстрым скоблящим движением шпателя по слизистой щеки, которая перед этой процедурой протирается, при легком надавливании, ватным тампоном. Полученный материал переносится на предметное стекло и окрашивается одной каплей 1% ацетоорсеина (свежепрофильтрованного). Препарат накрывается покровным стеклом, сверху прикладывается слой фильтровальной бумаги. После этого производят умеренное надавливание покровного стекла большим пальцем руки в течение нескольких секунд. Остатки красителя удаляются. Нельзя допускать сдвигание покровного стекла при этой процедуре! Изучение препарата производят в световом микроскопе с иммерсионной системой (х 1200— 1500), желательно с бинокулярной насадкой. На препарате половой хроматин должен быть обнаружен в виде тельца, окрашенного в темный цвет, размером около 1мкм и расположенного чаще всего под ядерной оболочкой (см.рис. 13.7). Поскольку тельце Барра (половой хроматин) в норме определяется в ядрах в среднем у 30% клеток женщин, необходимо осуществить просмотр нескольких полей зрения в разных местах препарата и просчитать не менее 100 ядер. Необходимо учитывать только прилежащие к ядерной оболочке тельца полового хроматина. Ацетоорсеин готовится по следующей методике: 1 г синтетического орсеина растворяется в 45 мл ледяной уксусной кислоты. Раствор доводится до кипения, охлаждается и фильтруется. К полученному раствору добавляются 55 частей дистиллированной воды. Производятся повторное кипячение, охлаждение и фильтрование. 13.3. Близнецовый метод |
