Биология. Итог по генетике. Генетика как наука. Предмет и задачи генетики. Наследственность и изменчивость (определение). Основные этапы развития генетики, их краткая характеристика. Роль генетики в современной биологии и медицине
 Скачать 1.66 Mb.
|
|
Цитоплазматическая наследственность. «Цитоплазматические гены». Плазмогены митохондрий и хлоропластов. Роль симбионтов (вирусов, плазмид, эписом) в цитоплазматической наследсвенности. Явление трансдукции и трансгенеза. Основные подходы к конструированию генетических структур и созданию современных биотехнологий. Кольцевая молекула ДНК митохондрий содержит 16 569 тыс. пар оснований. Митохондрии наследуются ребёнком от матери с цитоплазмой ооцитов, поэтому заболевание передаётся от матери всем детям независимо от пола ребёнка; больные отцы не передают заболевание детям, все дети будут здоровыми и передача заболевания прекращается. Мутации митохондриальной ДНК обнаруживаются около 30 различных заболеваний: атрофия зрительного нерва (синдром Лебера), митохондриальная миоэнцефалопатия и др. Мутации генов митохондриального генома лежат воснове митохондриальных болезней: Наследственной оптической нейропатии Лебера; Синдрома Лей (обусловлен дегенеративными изменениями ствола головного мозга) Нейросенсорная глухота; Синдрома Пирсона (нарушение кроветворения и функции поджелудочной железы); Митохондриальная кардиомиопатия; Синдром Альпера обусловлен дегенерацией тканей головного мозга( деменция, слепота, дисфункция печени. Наличие некоторого количества наследственного материала в цитоплазме в виде кольцевых молекул ДНК митохондрий и пластид, а также других внеядерных генетических элементов дает основание специально остановиться на их участии в формировании фенотипа в процессе индивидуального развития. Цитоплазматические гены не подчиняются менделевским закономерностям наследования, которые определяются поведением хромосом при митозе, мейозе и оплодотворении. В связи с тем что организм, образуемый вследствие оплодотворения, получает цитоплазматические структуры главным образом с яйцеклеткой, цитоплазматическое наследование признаков осуществляется по материнской линии. Такой тип наследования был впервые описан в 1908 г. К. Корренсом в отношении признака пестрых листьев у некоторых растений Явление нехромосомного наследования было открыто в1909—1910 гг. немецкими исследователями Карлом Корренсом и Эрвином Бауром. В 1909 году было показано, что окраска листьев у ночной красавицы и львиного зеванаследуется по материнской лини. Э.Баур предположил, чтонаследование окраски листьев уданных растений связана спередачей потомству пластид. Онвыдвинул предположение, чтохлоропласты, какядро, несут наследственные факторы, способные мутировать, а при митозе пластиды распределяются случайным образом между дочерними клетками. Как было установлено позднее, развитие этого признака обусловлено мутацией, возникающей в ДНК хлоропластов и нарушающей синтез хлорофилла в них. Размножение в клетках нормальных (зеленых) и мутантных (бесцветных) пластид и последующее случайное распределение их между дочерними клетками приводят к появлению отдельных клеток, совершенно лишенных нормальных пластид. Потомство этих клеток образует обесцвеченные участки на листьях. Фенотип потомства, таким образом, зависит от фенотипа материнского растения. У растения с зелеными листьями потомство абсолютно нормально. У растения с бесцветными листьями потомство имеет такой же фенотип. У материнского растения с пестрыми листьями потомки могут иметь все описанные фенотипы по данному признаку. При этом внешний вид потомства не зависит от признака отцовского растения. Впервые цитоплазматическую наследственность (определяемая плазмогенами) выявил К.Коренс в опыте на чабреце. Признаки, которые контролируются плазмогенами передаются только по материнской линии(т.к всю цитоплазму потомок получает через яйцеклетку .Наиболее изучаемы оказались 2 вида цитоплазматической наследственности (пластидн. наследс. и ЦМС). Пластидная наследственность. В 1908-1909г. К.Коренсу у ночной красавицы и Э.Бауэр у герани описали пестролистность. К.Коренсу удалось обнаружить растение ночной красавицы ,у которой разные побеги имели разную окраску листьев: на побегах зеленые листья,на других не было хлорофилов ,в большинстве случаев пестрые.Причем на всех обр. были и семена.На таком растении К.Коренсу удалось сделать реципрокное скрещивание. При опылении цветка зеленого побега пыльцой всех 3-ёх типов побегов все потомки оказались зелеными.При опылении цветка безхлорофильного побега пыльцы всех 3-ёх все потомки без хлорофилла и погибли. При опылении цветков пестролистного побега пыльцой всех 3-ёх в потомстве оказалось расщепление на зеленых,пестролистных,безхлорофильных.Для объяснения таких результатов К.Коренспредложил,что наследование пестролистности определ. плазмогенами, располож . в самих пластидах и передаются по материнской линии. Расщепление в 3-ем случае К.Коренс объяснил случайным хар-ром распределения нормальных и аномальных по дочерним клеткам. Гены, входящие в состав цитоплазматических наследственных структур называются плазмогенами. 1.Цитоплазматические гены присутствуют в сотнях и тысячах копий в каждой клетке, поскольку в клетке может быть множество органелл, каждая из которых содержит несколько молекул ДНК. 2. Гены органелл расходятся при делении клеток по дочерним клеткам совершенно случайно, как по числу копий, так и по соотношению доминантных и рецессивных аллелей. 3. Цитоплазматические гены передаются, как правило, только через женские гаметы (т.е. по женской линии). 4. Цитоплазматические гены крайне редко рекомбинируют. 5. Цитоплазматические гены могут реплицироваться неоднократно за один клеточный цикл Хлоропласты и митохондрии содержат ДНК в виде маленьких кольцевых молекул, похожих на нуклеоидбактерий. • Молекулы ДНК находятся в хлоропластах и митохондриях в специальных зонах, называемых нуклеоидами. • Каждая органелла содержит множество нуклеоидов. • В нуклеоидах сосредоточено большое число молекул ДНК. Хлоропластный геном кодирует примерно 80 белков, содержит около 120 генов. Митохондриальный геном кодирует 15-20 белков и содержит 37 генов. Плазмогены митохондрий · Одна миотохондрия содержит 4 - 5 кольцевых молекул ДНК длинной около 15 000 пар нуклеотидов · Содержит гены : - синтеза т РНК , р РНК и белков рибосом , некоторых ферментов аэробного обмена и структурных белков внутренней мембраны митохондрий - устойчивость к антибиотикам некоторых организмов ( дрожжей ) - мужская стерильность растений - мутации митохондральных генов обуславливают некоторые пороки развития человека ( сращение нижних конечностей , раздвоение позвоночного столба ) · Плазмогенов митохондрий недостаточно для генетического контроля их структуры и функций (необходимо взаимодействие с ядерными генами , контролирующими синтез ферментов внутренней мембраны ) Плазмогены пластид ( пластидная наследственность ) · обуславливает пёстролистность у некоторых растений ( ночная красавица , львиный зев и др . ) чередование зелёных и бесцветных участков тканей листьев и стеблей ( пыльца растений не содержит пластид и наследование этого признака зависит только от материнского организма ) Плазмиды – широко распространенные в клетке внехромосомные генетические элементы, которые могут самостоятельно существовать и размножаться автономно от хромосомной ДНК. Эписомы – это плазмиды, которые реплицируются не автономно, а в составе хромосомной ДНК, в которую они включаются в определенные моменты. В прокариотической клетке имеются плазмиды, которые отвечают за способность бактерий к коньюгации и за устойчивость к некоторым лекарственным средствам. В эукариотической клетке плазмиды представлены митохондриями, пластидами и нуклеотидными последовательностями. Генетический материал плазмид содержится в матриксе и их ДНК не связана с гистоновыми белками. Плазмон – это совокупность генов, расположенных в цитоплазматической молекуле ДНК . Наследственность цитоплазматическая (внеядерная, нехромосомная, плазматическая), преемственность материальных структур и функциональных свойств организма, которые определяются и передаются факторами, расположенными в цитоплазме. Совокупность этих факторов - плазмагенов, или внеядерных генов, составляет плазмон (подобно тому, как совокупность хромосомных генов - геном). Плазмагены находятся в самовоспроизводящихся органеллах клетки - митохондриях и пластидах (в том числе хлоропластах и др.). Указанием на существование цитоплазматической наследственности служат, прежде всего, наблюдаемые при скрещиваниях отклонения от расщеплений признаков, ожидаемых на основе законов Менделя. Цитоплазматические элементы, несущие плазмагены, расщепляются по дочерним клеткам беспорядочно, а не закономерно, как гены, локализованные в хромосомах. Плазмагены передаются главным образом через женскую половую клетку (яйцеклетку), так как мужская половая клетка (спермий) почти не содержит цитоплазмы (что, однако, не исключает передачи плазмагенов через мужские гаметы). Поэтому изучение цитоплазматической наследственности ведётся с использованием специальных схем скрещивания, при которых данный организм (или группа) используется и как материнская, и как отцовская форма (реципрокное скрещивание). В прокариотической клетке имеются плазмиды, которые отвечают за способность бактерий к коньюгации и за устойчивость к некоторым лекарственным средствам. В эукариотической клетке плазмиды представлены митохондриями, пластидами и нуклеотидными последовательностями. Генетический материал плазмид содержится в матриксе и их ДНК не связана с гистоновыми белками. Некоторые виды цитоплазматической наследственности связаны с присутствием в цитоплазме эукариот эндосимбионтов — бактерий или вирусов. Эндосимбионтами называют организмы, живущие в клетках другого организма независимо от того, выгодно это последнему или нет. Генетически эндосимбиоз хорошо исследован на примере каппа-частиц инфузории туфельки. Генетические исследования показали, что каппа-бактерии наследуются с цитоплазмой, но способны поддерживаться лишь в парамециях, несущих доминантную ядерную аллель К, необходимую для репродукции каппа-бактерий. При скрещивании парамеций-убийц (КК) с чувствительными особями (kk) характер гетерозиготного потомства Кk зависит от того, успеют ли конъюгирующие клетки обменяться цитоплазмой. В случае длительного скрещивания такой обмен происходит и все потомство с генотипом Кk и цитоплазмой родителя КК имеет фенотип «убийцы». При кратковременной конъюгации после скрещивания клетки расходятся каждая со своей цитоплазмой, поэтому, имея общий генотип Кк, они различаются по фенотипу. Особи, получившие цитоплазму от родителя КК, являются «убийцами». Напротив, особи Кк, получившие цитоплазму от родителей kk, оказываются чувствительными. При последующей аутогамии образуются гомозиготные клоны, фенотип которых зависит от присутствия гена К в ядре и каппа-бактерий в цитоплазме. С эндосимбиозом связаны и некоторые признаки у дрозофил. Один из них, известный как «соотношение полов», или SR (от англ. sex ratio), заключается в том, что у ряда видов дрозофил в потомстве либо вовсе не обнаруживаются самцы, либо их количество значительно меньше ожидаемых 50%. Имеются данные, показывающие, что этот признак передается по материнской линии и обусловлен присутствием в цитоплазме клеток дрозофилы симбионтов типа спироплазм, относящихся к роду спирохет Treponema, содержащих вирусы, но контролируется также некоторыми ядерными генами. Другой признак дрозофилы, определяемый внеядерным генетическим компонентом,— необычно высокая чувствительность некоторых линий мух к СО2, используемому для наркоза при генетических исследованиях. Этот признак, наследующийся по материнской линии, обусловлен присутствием в цитоплазме вирусоподобной частицы σ. Чувствительные мухи парализуются и гибнут от концентраций СО2, которые для нормальных мух имеют только усыпляющее действие. Трансдукцией называется перенос генетического материала с помощью вирусов из клетки-донора в клетку-реципиент. Явление трансдукции открыл в 1951 г. Н. Зиндер (ученик Дж. Ледерберга). При трансдукции в вирионы попадает ДНК клетки-хозяина. Вирионы заражают другие клетки, и ДНК исходной бактериальной клетки проникает в другую бактериальную клетку. Вирусная ДНК интегрируется в бактериальную хромосому, а привнесенная бактериальная ДНК рекомбинирует с ДНК бактериальной хромосомы. В результате 50% клеток оказываются трансформированными. Различают: общую (неспецифическую), ограниченную (специфическую), абортивную трансдукцию. При общей трансдукции фрагменты бактериальной ДНК донора случайно включаются в созревающую фаговую частицу вместе с фаговой ДНК или вместо фаговой ДНК. Фрагменты бактериальной ДНК образуются при ее разрезании ферментом, контролируемым фагом. В состав фаговой частицы может включаться до 100 бактериальных генов. При ограниченной трансдукции происходит рекомбинация – бактериальная ДНК замещает часть фаговой ДНК. В состав рекомбинантной ДНК входит небольшое количество бактериальных генов, прилежащих к фаговой ДНК, интегрированной в бактериальную хромосому. При общей и ограниченной трансдукции донорская ДНК замещает гомологичные участки ДНК реципиента. Этот процесс сходен с трансформацией. Абортивная трансдукция может быть и неспецифической, и специфической. Ее сущность заключается в том, что трансдуцируемый фагом фрагмент ДНК не включается в хромосому реципиента, а существует как цитоплазматический репликон. Рано или поздно этот репликон утрачивается. Явление трансдукции вирусами широко используется при переносе генов у эукариот. Если применяется вирус, неспособный формировать капсид (то есть существующий только в форме ДНК), то трансдукция принципиально не отличается от трансформации или от конъюгативного переноса генетического материала с помощью плазмид–векторов. Созданы системы векторов на основе модифицированных вирусов SV40 (они образуют в клетке до 100 тысяч копий), герпеса, осповакцины, вирус мозаики цветной капусты. Следует еще раз подчеркнуть, что все описанные типы рекомбинации связаны не с добавлением новых участков ДНК, а с замещением уже имеющихся нуклеотидных последовательностей. Чем выше степень гомологии трансформирующей и исходной ДНК, тем выше вероятность успешной рекомбинации. Легче всего удается рекомбинация ферментов, имеющихся у всех организмов. Труднее ввести в геном новые регуляторы, отличающиеся высокой специфичностью. Поэтому длявнедрения в геном новых генов используются более сложные методы, связанные с биохимическими модификациями ДНК. Трансгенез – это техника переноса экзогенной ДНК, то есть генов, через клетки зародыша в целый новый организм. Эксплуатируя этот метод, можно получать животных, несущих качественно новые признаки. Например, возможно создание пород, устойчивых к заболеваниям или несущих новые, полезные для промышленной деятельности человека признаки. С распространением трансгенеза процесс создания новых пород и линий продуктивных животных значительно ускорится, кроме того, этот метод позволяет уже в настоящее время перенести исследования функциональной активности генов in vitro (на культурах клеток) в условия in vivo (на живых организмах), что важно для понимания фундаментальных основ жизни. По мнению многих видных ученых, технология создания трансгенных животных - это одна из наиболее захватывающих отраслей науки, появившихся в последние два десятилетия. Производство человеческих рекомбинантных медицинских препаратов из молока трансгенных животных служит выходом из многих затруднений, связанных с микробными биореакторами, таких как отсутствие у бактерий посттрансляционных модификаций белков, неправильное складывание молекул синтезируемого вещества, высокие расходы на очищение. Использование клеточных культур животных в качестве биореакторов характеризуется высокими расходами на культуральные среды и невысоким выходом продукта. Поэтому многие специалисты в области клонирования видят главную задачу в применении технологии переноса ядер для создания и размножения трансгенных животных с полезными свойствами. трансгенез молекула регенерация днк 1. Общие этапы трансгенеза 1. Первый этап получения заключается в создании искусственной генетической структуры в виде рекомбинантной молекулы ДНК с заданными свойствами. Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in vitro двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников. Определенные фрагменты ДНК, в том числе содержащие гены, получают с использованием рестриктаз. Соединение их в единую молекулу производится несколькими методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК. Конструирование рекомбинантных ДНК Ключевыми вопределении рекомбинантной ДНК являются слова "фрагмент ДНК" и "объединение in vitro", что указывает на сущность генетической инженерии и ее отличие от всех остальных методов получения гибридных (или химерных) организмов, таких как генетическая селекция, эмбриональная инженерия и т.д. Фрагменты ДНК, в том числе и фрагменты, содержащие гены, получают с использованием ферментов рестриктаз. Рестриктазы могут образовывать фрагменты как с тупыми, так и с липкими концами. Сшивка фрагментов ДНК производится тремя основными методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК. Сшивка по одноименным "липким" концам (рестриктазно-лигазный метод) Этот метод является самым распространенным и популярным. Впервые этим способом гибридная ДНК была получена С. Коэном с сотрудниками в 1973 году. Некоторые рестриктазы, например Pst I, внося в цепи ДНК симметричные, расположенные наискось друг от друга разрывы на равных расстояниях от центра сайта узнавания и образующие "ступеньку" (рис. 36). Эти комплементарные друг другу участки имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания оснований, и поэтому их называют комплементарными или липкими концами. Спаривание оснований происходит только между комплементарными последовательностями, поэтому ААТТ-концы, образуемые Eco RI, не будут спариваться, например, с АГЦТ-концами, образуемыми Hind III. Но любые два фрагмента (независимо от их происхождения), образовавшиеся под действием одной и той же рестриктазы, могут слипаться за счет образования водородных связей между однонитевыми участками комплементарных нуклеотидов. Однако после такого спаривания полной целостности двойной спирали не восстановится, поскольку останется два разрыва в фосфодиэфирном остове. Для его восстановления, то есть сшивания, или лигирования нитей используют фермент ДНК-лигазу. Этот фермент в живой клетке выполняет ту же функцию - сшивание фрагментов ДНК, синтезирующихся при репликации. Сшивка по "тупым" концам (коннекторный метод) Липкие концы не абсолютно необходимы для связывания фрагментов ДНК. Тупые концы также могут быть соединены за счет действия ДНК-лигазы, если и лигаза, и тупые концы присутствуют в реакционной смеси в высоких концентрациях. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность ниже, чем при сшивке по липким концам. Впервые такие эксперименты были выполнены в 1972 году Полем Бергом в Стенфордском университете, США. Липкие концы также можно ферментативным путем присоединить к молекулам ДНК с тупыми концами. Для этого используют фермент - концевую трансферазу из тимуса теленка, которая присоединяет нуклеотиды к 3 -концам цепей ДНК. Если к 3'-концам одного из рекомбинируемых in vitro фрагментов ДНК с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы достроить одноцепочечные олиго (dA)-сегменты определенной длины, а к концам другого фрагмента — олиго (dT)-сегменты примерно такой же длины, то при смешении полученных таким образом фрагментов происходит спаривание за счет образования водородных связей между олиго (dА)- и олигo (dT) -последовательностями (рис. 40). Для ковалентного соединения двух фрагментов используется ДНК-лигаза. Эти процедуры составляют основу для второго общего метода получения рекомбинантных молекул ДНК. Поскольку можно формировать достаточно длинные взаимокомплементарные одноцепочечные концы, гибридные молекулы образуются с высокой эффективностью. В частности, поэтому при клонировании ДНК-копий матричных РНК, которые доступны в ограниченных количествах, обычно ис¬пользуют коннекторный метод. При таком способе соединения между фрагментами встраиваются участки ААААА. Такие дополнительные последовательности ТТТТТ могут влиять на функции соединяемых молекул и поэтому всегда, когда только возможно, для получения рекомбинантных молекул ДНК пользуются липкими концами, образовавшимися в результате действия рестриктаз. Сшивка фрагментов с разноименными липкими концами В ситуации, когда необходимо сшить фрагменты, образованные разными эндонуклеазами рестрикции, и имеющие разные, то есть некомплементарные друг другу липкие концы, применяют так называемые линкеры (или "переходники"). Линкеры - это химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию. Впервые эту идею предложил Шеллер с сотрудниками в 1977 году. Существуют большие наборы таких генных "переходников". Естественно, что при использовании линкеров должна учитываться необходимость соблюдения правил экспрессии генетической информации. Часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторный генетический элемент, например, промотор или участок, связанный с рибосомой. В этом случае линкеры обеспечивают не только объединение генов, но и обуславливают их экспрессию. Существуют линкеры "тупой конец - липкий конец". При необходимости липкие концы можно превратить в тупые. Это достигается либо отщеплением липких концов с помощью фермента - эндонуклеазы S1, которая разрушает только одноцепочечную ДНК, либо липкие концы "застраивают", то есть с помощью ДНК-полимеразы I на однонитевых липких концах синтезируют вторую нить. В литературе [8] выделяют 3 основных метода биотехнологии: · Генная инженерия; · Клеточная инженерия; · Клонирование. С помощью методов клеточной и генной инженерии возможно получение новых высокопродуктивных продуцентов белков и пептидов человека, антигенов, вирусов и др. Развитие генетической и клеточной инженерии приводит к тому, что биотехнологическая промышленность все шире завоевывает новые области производства. Фундаментом для возникновения новейших методов биотехнологии послужили открытия в генетике, молекулярной биологии, генетической энзимологии, вирусологии, микробиологии и других дисциплинах [11]. |