I. общая часть (бактериология, микология, вирусология, микробная экология, санитарная микробиология)
 Скачать 5.14 Mb.
|
23. Реакция гемагглютинации, торможения гемагглютинации и гемадсорбции в вирусологической практике.Реакция гемагглютинации (РГА). В лаборатории пользуются двумя различными по механизму действия реакциями гемагглютинации. Первая РГА относится к серологическим. В этой реакции эритроциты агглютинируются при взаимодействии с соответствующими антителами (гемагглютининами). Реакцию широко используют для определения групп крови. Вторая РГА не является серологической. В ней склеивание эритроцитов вызывают не антитела, а особые вещества, образуемые вирусами. Например, вирус гриппа агглютинирует эритроциты кур и морских свинок, вирус полиомиелита - эритроциты барана. Эта реакция позволяет судить о наличии того или иного вируса в исследуемом материале. Реакцию проводят в пробирках или на специальных пластинках с лунками. Исследуемый на наличие вируса материал разводят изотоническим раствором от 1:10 до 1:1280; 0,5 мл каждого разведения смешивают с равным объёмом 1-2% взвеси эритроцитов. В контроле 0,5 мл эритроцитов смешивают с 0,5 мл изотонического раствора. Пробирки ставят на 30 минут в термостат, а пластины оставляют при комнатной температуре на 45 минут. Учёт результатов. При положительном результате реакции на дне пробирки или лунки выпадает осадок эритроцитов с фестончатыми краями («зонтик»), покрывающий всё дно лунки. При отрицательном результате эритроциты образуют плотный осадок с ровными краями («пуговку»). Такой же осадок должен быть в контроле. Интенсивность реакции выражают знаками «+». Титром вируса является максимальное разведение материала, в котором происходит агглютинация. Реакция торможения гемагглютинации Это серологическая реакция, в которой специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), нейтрализуют его и лишают способности агглютинировать эритроциты, т. е. тормозят реакцию гемагглютинации. Эта реакция позволяет определить вид и тип вирусов. Постановка реакции. 0,25 мл противовирусной сыворотки смешивают с равным объёмом материала, содержащего вирус. Смесь встряхивают и помещают в термостат на 30 минут, после чего добавляют по 0,5 мл'1-2% взвеси эритроцитов. Учёт результатов. При правильной постановке опыта в контроле сыворотки и эритроцитов должна образоваться «пуговка» - нет агглютинирующего эритроциты фактора; в контроле антигена образуется «зонтик» - вирус вызвал агглютинацию эритроцитов. Если сыворотка гомологична изучаемому вирусу, образуется «пуговка» - сыворотка нейтрализовала вирус. Реакция гемадсорбции (РГАд). Гемадсорбция - это соединение эритроцитов с поверхностью пораженных вирусом клеток, основанное на родстве рецепторов вируса, находящихся на поверхности пораженной клетки, с рецепторами эритроцита, что приводит к их взаимному сцеплению аналогично реакции гемагглютинации. Преимущество этой реакции состоит в том, что она становится положительной еще до появления отчетливых цитопатических изменений в инфицированных клетках. Наблюдаютсяразличия в типе адсорбции (диффузный, очаговый), виде сорбируемых эритроцитов (человека, обезьян,морской свинки и др.), температуре, при к-рой протекает реакция (37°С , 0°С), наличии элюции (есть, нет). Г.может быть заторможена предварительной инкубацией инфицированной вирусом к-ры клеток соспецифической к вирусу антисывороткой. Реакцию торможения Г. используют для идентификации вирусов. 24. Реакция преципитации. Преципитация в геле. Иммуноэлектрофорез.Р-ция преципитации – осаждение мелкодисперсного или растворимого Аг под действием специфических Ат с образованием преципитата. Отличия от реакции агглютинации: 1. Аг мелкий 2. Р-ция преципитации может проходить в жидкой фазе, тогда образуется кольцо или в геле 3. Реакция высокой чувствительности 4. Внизу в пробирке всегда находится Ат или сыворотка Преципитация в геле (агаре): А) метод встречной иммунодиффузии по Оухтерлони Эта р-я проводится в агаровом геле. В слое геля равномерной толщины на опр расстоянии др. от др. вырезают лунки и заполняют их Аг и иммунной сывороткой соответственно. После этого Аг и Ат диффундируют в гель, встречаются др. с др. и обр-ют иммунные комплексы, к-е опр-ют как линии прец-и. Эту р-ю можно исп-ть для опр-я неизвестных Аг и Ат, а также для проверки сходства между различным Аг: если Аг идентичны – линии преципитации сливаются, если нет - линии преципитации пересекаются, если Аг частично идентичны – формируется «шпора». Б) радиальная иммунодиффузии (метод Манчини) В расплавл.й агаровый гель (Т его не должна превышать 56 градусов) добавляют Ат и наносят гель равным слоем на стекло. В геле вырезают лунки и в них стандартный V различных по конц-и р-ров Аг. Во время инкубации Аг радиально диффундируют из лунки и, встретившись с Ат, обр-ют кольцо прец-и. До тех пор пока в лунке сохр-ся избыток Аг, происхт постепенное увелич d кольца преципитата. Этот метод для опр-я Аг или Ат в исследуемом растворе, например, для определения концентрации разных классов иммуноглобулинов в сыворотки крови. Иммуноэлектрофорез: предварительно электрофоретически разделяют смесь Аг, затем в канавку, идущую вдоль направления движения белков, вносят преципитирующую антисыворотку. Аг и Ат диффундируют в гель навстречу др. др., взаимодействуя, они образуют дугообразные линии преципитации. |