Темы и лекции 1 модуля. Обычные Bacillus subtilis 0,70,8x23 Escherichia coli 0,31х16 Staphylococcus aureus 0,51,0 Thiobacillus thioparus 0,5х13 Rickettsia prowazeki 0,30,6x0,82 Мелкие
 Скачать 2.33 Mb.
|
|
Макрометод. Тестирование проводится в объеме 1 мл каждого разведения антибиотика с конечной концентрацией микроорганизма примерно 5х105 КОЕ/мл. Питательный бульон разливают по 0.5 мл в каждую пробирку. Затем 0,5 мл раствора антибиотика стерильной пипеткой вносят в первую пробирку с 0,5 мл бульона. Перемешивают и вновь переносят 0,5 мл из этой пробирки во вторую пробирку, также первоначально содержащую 0,5 мл бульона. Получается ряд пробирок с растворами антибиотика, концентрация которого отличается от соседних в 2 раза. Для инокуляции используют стандартную микробную взвесь, эквивалентную стандарту мутности 0,5 по МакФарланду, разведенную в 100 раз на питательном бульоне, после чего ее концентрация в среде составит 106 КОЕ/мл. По 0,5 мл инокулюма вносят в каждую пробирку с 0,5 мл соответствующего разведения антибиотика и в одну пробирку с 0,5 мл бульона без антибиотика («отрицательный» контроль). Пробирки закрывают стерильными ватно-марлевыми пробками или металлическими колпачками, инкубируют при 37 °С. Сроки инкубации зависят от вида микроорганизма (16-24 ч). Определяют МИК, которая соответствует концентрации препарата в последней пробирке с видимой задержкой роста (прозрачная питательная среда). Микрометод (с использованием коммерческих тест-систем). Постановка во многом сходна с макрометодом. Чаще используют 96-луночные планшеты для иммунологических исследований. Преимуществом метода является возможность одновременно применять достаточное количество планшетов с растворами антибиотиков, длительно хранить их в холодильнике и использовать по мере необходимости. Первым этапом является изготовление планшетов, пригодных для хранения. Концентрацию рабочих растворов антибиотиков, вносимых в лунки планшетов, рассчитывают исходя из схемы последующей инокуляции – необходимо создание в лунке конечной концентрации исследуемого микроорганизма. После внесения антибиотиков в лунки, запаянные планшеты могут храниться при температуре ниже –60 °С до момента использования. Повторное замораживание не допускается. Планшеты после извлечения из холодильника выдерживают до достижения ими комнатной температуры. Инокуляцию проводят в течение 15 мин после приготовления суспензии. Инкубацию осуществляют при 37 °С в течение 16…20 ч. Учет результатов при постановке макро- и микрометодов проводят визуально по появлению видимой мутности или спектрофотометрически, сравнивая рост в присутствии антибиотика с ростом в ячейке без него. За МИК принимают минимальную концентрацию, обеспечивающую полное подавление видимого роста. Использование тест-систем на основе метода микроразведений позволяет избегать трудоемких процедур по стандартизации подготовительных этапов, но при этом обеспечивает получение достоверных количественных результатов по уровню антибиотикорезистентности. Наследственная информация хранится у бактерий в форме последовательности нуклеотидов ДНК, которые определяют последовательность аминокислот в белке. Каждому белку соответствует свой ген, т.е. дискретный участок на ДНК, отличающийся числом и специфичностью последовательности нуклеотидов. Совокупность всех генов бактерий называется геномом. Геном бактерий имеет гаплоидный набор генов. Бактериальный геном состоит из генетических элементов, способных к самостоятельной репликации (воспроизведению), т.е. репликонов. Репликонами являются бактериальная хромосома и плазмиды. Бактериальная хромосома представлена одной двухцепочечной молекулой ДНК. Она кодирует жизненно важные для бактериальной клетки функции. Плазмиды – наипростейшие организмы, лишенные оболочки, собственных систем синтеза белка и мобилизации энергии и представляют собой особый класс абсолютных внутриклеточных паразитов, наделяющих своих бактерий-хозяев полезными для них свойствами. Плазмиды и их функции · F-плазмиды – донорские функции · R-плазмиды – устойчивость к лекарственным препаратам · Col-плазмиды – синтез колицинов · Ent-плазмиды – синтез энтеротоксинов · Hly-плазмиды – синтез гемолизинов · Биодегративные плазмиды – разрушение различных органических и неорганических соединений, в т.ч. содержащих тяжелые металлы. Особое значение в медицинской микробиологии имеют плазмиды, обеспечивающие устойчивость бактерий к антибиотикам, которые получили название R-плазмид (от англ. resistance — противодействие), и плазмиды, обеспечивающие продукцию факторов патогенности, способствующих развитию инфекционного процесса в макроорганизме. R-плазмиды содержат гены, детерминирующие синтез ферментов, разрушающих антибактериальные препараты (например, антибиотики). В результате наличия такой плазмиды бактериальная клетка становится устойчивой (резистентной) к действию целой группы лекарственных веществ, а иногда и к нескольким препаратам. Многие R-плазмиды являются трансмиссивными, распространяясь в популяции бактерий, делая ее недоступной к воздействию антибактериальных препаратов. Бактериальные штаммы, несущие R-плазмиды, очень часто являются этиологическими агентами внутрибольничных инфекций. Подвижные генетические элементы обнаружены в составе бактериального генома как в бактериальной хромосоме, так и в плазмидах. К подвижным генетическим элементам относятся вставочные последовательности и транспозоны. Вставочные (инсерционные) последовательности — IS-элементы (от англ. insertion sequences) — это участки ДНК, способные как целое перемещаться из одного участка репликона в другой, а также между репликонами. IS-элементы различаются по размеру, типу и количеству инвертированных повторов. Транспозоны — это сегменты ДНК, обладающие теми же свойствами, что и IS-элементы, но имеющие в своем составе структурные гены, т.е. гены, обеспечивающие синтез молекул, обладающих специфическим биологическим свойством, например токсичностью, или обеспечивающих устойчивость к антибиотикам. Перемещение подвижных генетических элементов по репликону или между репликонами вызывает: • инактивацию генов тех участков ДНК, куда они, переместившись, встраиваются; • образование повреждений генетического материала; • слияние репликонов, т.е. встраивание плазмиды в хромосому; • распространение генов в популяции бактерий, что может приводить к изменению биологических свойств популяции, смене возбудителей инфекционных заболеваний, а также способствует эволюционным процессам среди микробов. Интегроны. Помимо плазмид и подвижных генетических элементов, у бактерий существует еще одна система, способствующая распространению генов, — система интегронов. Интегроны являются системой захвата малых элементов ДНК, называемых генными кассетами, посредством сайтспецифической рекомбинации и их экспрессии. Интегрон состоит из консервативного участка, расположенного на 5' конце, который содержит ген, кодирующий фермент интегразу, сайт рекомбинации att и промотор Р. Интегроны могут располагаться как на хромосоме, так и на плазмидах. Поэтому возможно перемещение кассет с одного интегрона на другой как в пределах одной бактериальной клетки, так и по популяции бактерий. Один интегрон может захватывать несколько кассет антибиотикорезистентности. Изменения 5'консервативный фрагмент бактериального генома, а, следовательно, и свойств бактерий могут происходить в результате мутаций и рекомбинаций. Острова патогенности. В геноме патогенных бактерий имеются участки ДНК протяженностью не менее 10 000 пар нуклеотидов, которые отличаются от основного генома составом Г–Ц-пар нуклеотидных оснований. Эти участки ответственны за синтез факторов патогенности, которые обеспечивают развитие патологического процесса в организме хозяина, поэтому были названы островами патогенности. Большинство островов патогенности локализовано на хромосоме бактерий (Salmonella), но также они могут находиться в составе плазмид (Shigella) и фаговых ДНК (V. cholerae 0 1 , 0139). Знание механизмов изменчивости микроорганизмов необходимо для правильного понимания природы инфекционного процесса и выбора оптимальных методов этиотропной терапии инфекционных заболеваний. Мутации — это изменения в последовательности отдельных нуклеотидов ДНК, которые фенотипически ведут к таким проявлениям, как изменения морфологии бактериальной клетки, возникновение потребностей в факторах роста, например в аминокислотах, витаминах, т.е. ауксотрофности, к устойчивости к антибиотикам, изменению чувствительности к температуре, снижению вирулентности (аттенуация) и т.д. Мутация, приводящая к потере функции, называется прямой мутацией. У мутантов может произойти восстановление исходных свойств, т.е. реверсия (от англ. reverse — обратный). Если происходит восстановление исходного генотипа, то мутация, восстанавливающая генотип и фенотип, называется обратной или прямой реверсией. Если мутация восстанавливает фенотип, не восстанавливая генотип, то такая мутация называется супрессорной. Супрессорные мутации могут возникать как в пределах того самого гена, в котором произошла первичная мутация, так и в других генах или могут быть связаны с мутациями в тРНК. По протяженности изменений повреждения ДНК различают мутации точечные, когда повреждения ограничиваются одной парой нуклеотидов, и протяженные или аберрации. В последнем случае могут наблюдаться выпадения нескольких пар нуклеотидов, которые называются делецией, добавление нуклеотидных пар, т.е. дупликации, перемещения фрагментов хромосомы, транслокации и перестановки нуклеотидных пар — инверсии. Мутации могут быть спонтанными, т.е. возникающими самопроизвольно, без воздействия извне, и индуцированными. Точенные спонтанные мутации возникают в результате ошибок при репликации ДНК, что связано с таутомерным перемещением электронов в азотистых основаниях. Индуцированные мутации появляются под влиянием внешних факторов, которые называются мутагенами. Мутагены бывают физическими (УФ-лучи, у-радиация), химическими (аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований, азотистая кислота и ее аналоги и другие соединения) и биологическими — транспозоны. Генетическая рекомбинация — это взаимодействие между двумя ДНК, обладающими различными генотипами, которое приводит к образованию рекомбинантной ДНК, сочетающей гены обоих родителей. Гомологичная рекомбинация. При гомологичной рекомбинации в процессе разрыва и воссоединения ДНК происходит обмен между участками ДНК, обладающими высокой степенью гомологии. Сайтспецифическая рекомбинация. Этот тип рекомбинации не зависит от функционирования генов rec А, В, С, D не требует протяжных участков гомологии ДНК, но для протекания которой необходимы строго определенные последовательности ДНК и специальный ферментативный аппарат, которые специфичны для каждого конкретного случая. Примером этого типа рекомбинации является встраивание плазмиды в хромосому бактерий, которое происходит между идентичными TS- элементами хромосомы и плазмиды, интеграция ДНК фага лямбда в хромосому Е. coli. Сайтспецифическая рекомбинация, происходящая в пределах одного репликона, участвует также в переключении активности генов. Например, у сальмонелл следствием этого процесса являются фазовые вариации жгутикового Н-антигена. Незаконная или репликативная рекомбинация. Незаконная или репликативная рекомбинация не зависит от функционирования генов rec А, В, С, D. Примером ее является транспозиция подвижных генетических элементов по репликону или между репликонами, при этом, транспозиция подвижного генетического элемента сопровождается репликацией ДНК. Рекомбинация у бактерий является конечным этапом передачи генетического материала между бактериями, которая осуществляется тремя механизмами: конъюгацией (при контакте бактерий, одна из которых несет конъюгативную плазмиду), трансдукцией (при помощи бактериофага), трансформацией (при помощи высокополимеризованной ДНК). Диссоциацияявляется формой изменчивости бактерий вследствие возможности образования двух форм бактериальных клеток на плотной питательной среде - R -колоний и S-колоний. Гетероморфизм – под влиянием физических, химических и биологических агентов некоторые микроорганизмы принимают форму больших шаров, утолщенных нитей, колбовидных образований, ветвлений, напоминающих мицелии гриба. Передача генетической информации у бактерий Конъюгация – процесс обмена генетическим материалом (хромосомнм и плазмидным), осуществляемый при непосредственном контакте клеток донора и реципиента. Трансдукция. Трансдукцией называют передачу бактериальной ДНК посредством бактериофага. Сексдукция – процесс переноса генетического материала между бактериальными клетками, осуществляемый F´-плазмидами с помощью механизма, аналогичного специфической трансдукции. Трансформация – перенос генетического материала, заключающийся в том, что бактерия- реципиент захватывает (поглощает) из внешней среды фрагменты чужеродной ДНК. Процесс трансформации зависит от компетентности клетки-реципиента и состояния донорской трансформирующей ДНК. Компетентность — это способность бактериальной клетки поглощать ДНК. Она зависит от присутствия особых белков в клеточной мембране, обладающих специфическим аффинитетом к ДНК. Трансформирующей активностью обладает только двунитевая высокоспирализованная молекула ДНК. Это связано с тем, что в клетку-реципиент проникает только одна нить ДНК, тогда как другая — на клеточной мембране — подвергается деградации с высвобождением энергии, которая необходима для проникновения в клетку сохранившейся нити. Трансфекция – вариант трансформации бактериальных клеток, лишенных клеточной стенки, осуществляемый вирусной (фаговой) нуклеиновой кислотой. Бактериофаги или фаги (от «бактерия» и греч. phagos — пожирающий) — вирусы, специфически проникающие в бактерии, использующие их биосинтетические системы для своей репродукции и вызывающие их лизис (растворение, разрушение клеток). Достоинства фагов перед антибиотиками: · бактериофаги помогают уничтожить микробы, малочувствительные к антибиотикам, причем они действуют целенаправленно; · фаги постоянно эволюционируют; · не вызывают привыкания и побочных эффектов; · не подавляют и не нарушают действия человеческого организма; · не оказывают негативного воздействия на иммунитет; · не вызывают привыкания патогенных бактерий; · их можно сочетать со всеми лекарственными препаратами; · можно использовать в качестве профилактики бактериальных инфекций; · они оказывают положительное влияние на становление иммунитета. Однако есть и минусы: 1. Бактериофаги строго специфичны, поэтому их очень трудно подбирать. Если нужной бактерии в организме не оказывается, а те, что вызвали заболевание, чуть-чуть отличаются, вирус находится в организме около 2-6 дней, а затем разрушается. 2. Лечение бактериофагами очень длительное. Если для курса антибиотикотерапии требуется обычно 5-7 дней, то бактериофаги назначают тремя курсами по 7-20 дней с небольшим интервалом. Есть мнение, что бактериофаги могут переносить от одной бактерии к другой участки ее генома, а значит и различные признаками: патогенность, устойчивость к антибиотикам и прочие. Механизм действия фагов: Действие бактериофагов избирательно. Попадая в организм, они находят "свою" бактерию, проникают в нее и начинают размножаться. В результате от патогенной бактерии остаются лишь обломки, зато образуются около 10-200 новых фагов. Полный цикл действия фагов, с момента заражения вредоносного микроорганизма до появления потомства - продолжается 15-40 минут в зависимости от его разновидности. Действие бактериофагов строго избирательно, поэтому ученые даже не стали давать им имена, так как намного проще называть их по имени бактерии, на которую они действуют. Наиболее известны стрептококковые, дизентерийные, стафилококковые, колийные, протейные, клебсиелезные и псевдомонадные фаги. Взаимодействие фагов с бактериями может протекать, как и у других вирусов, по продуктивному, абортивному и интегративному типам. При продуктивном типе взаимодействия образуется фаговое потомство, бактерии лизируются; при абортивном типе фаговое потомство не образуется и бактерии сохраняют свою жизнедеятельность, при интегративном типе геном фага встраивается в хромосому бактерии и сосуществует с ней. В зависимости от типа взаимодействия различают вирулентные и умеренные бактериофаги. Вирулентные бактериофаги взаимодействуют с бактерией по продуктивному типу. Проникнув в бактерию, они репродуцируются с образованием 200—300 новых фаговых частиц и вызывают лизис бактерий. Взаимодействие фагов с бактериальной клеткой характеризуется определенной степенью специфичности, что явилось основанием для подразделения их на: поливалентные фаги, способные взаимодействовать с родственными видами бактерий, моновалентные фаги, взаимодействующие с бактериями определенного вида, и типовые фаги, взаимодействующие с отдельными типами (вариантами) данного вида бактерий. Умеренные бактериофаги, в отличие от вирулентных, взаимодействуют с чувствительными бактериями либо по продуктивному, либо по интегративному типу. Продуктивный цикл умеренного фага идет в той же последовательности, что и у вирулентных фагов, и заканчивается лизисом клетки. При интегративном типе взаимодействия ДНК умеренного фага встраивается в хромосому бактерии, причем в строго определенную гомологическую область хромосомы, реплицируется синхронно с геномом размножающейся бактерии, не вызывая ее лизиса. ДНК бактериофага, встроенная в хромосому бактерии, называется профагом, а культура бактерий, содержащих профаг, — лизогенной. Само же биологическое явление сосуществования бактерии и умеренного бактериофага носит название лизогении (от греч. lysis — разложение, genea — происхождение). Профаг, ставший частью хромосомы размножающейся бактерии, передается по наследству от клетки к клетке неограниченному числу потомков. Лизогенные бактерии не образуют структурные вирусные белки и, следовательно, фаговое потомство. Геном профага может придавать бактерии новые, ранее отсутствовавшие у нее свойства. Этот феномен изменения свойств микроорганизмов под влиянием профага получил название фаговой конверсии (от лат. conversion — превращение). Конвертироваться могут морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие свойства бактерий. Например, только лизогенные культуры дифтерийной палочки способны вызвать болезнь (дифтерию), так как содержат в хромосоме профаг, ответственный за синтез белкового экзотоксина. Умеренные фаги могут быть дефектными, т.е. неспособными образовывать зрелые фаговые частицы ни в естественных условиях, ни при индукции. Геном некоторых умеренных фагов (Р1) может находиться в цитоплазме бактериальной клетки в так называемой плазмидной форме, не включаясь в ее хромосому. Такого рода умеренные фаги используют в качестве векторов в генетической инженерии. |