Сборник всех лекций. Общая характеристика обмена веществ и энергии. Биоэнергетика
 Скачать 3.68 Mb.
|
ЦИКЛ ТРИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ (ЦТК)(ЦИКЛ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ)План: Окислительное декарбоксилирование пирувата. Биологическая роль ЦТК. Химические превращения ЦТК. Энергетический эффект ЦТК. Регуляция ЦТК. Анаболические функции цитратного цикла Заключительный этап катаболизма многих биоорганических соединений (углеводов, жирных кислот и большинства аминокислот) представляет собой окисление в цикле трикарбоновых кислот или цикле лимонной кислоты до СО2 и Н2О. Центральным метаболитом является ацетил-КоА, именно в этой форме большая часть "топливных" молекул включается в цикл лимонной кислоты. Ацетил-КоА образуется в специфических реакциях катаболизма жирных кислот и некоторых аминокислот. Однако главным источником ацетил-КоА служит пировиноградная кислота, образующаяся в реакциях катаболизма глюкозы и некоторых аминокислот.  Катаболизм основных пищевых веществ. 1-3 - пищеварение; 4-8 - специфические пути катаболизма; 9-10 - заключительный (общий путь) катаболизма; 11 - ЦПЭ; 12 - окислительное фосфорилирование. Превращение пирувата в ацетил-КоА происходит при участии набора ферментов, структурно объединённых в пируватдегидрогеназный комплекс (ПДК). Ацетильный остаток - ацетил- Ко А далее окисляется в цикле лимонной кислоты до СО2 и Н2О. В этих реакциях окисления принимают участие NAD- и FAD-зависимые дегидрогеназы, поставляющие электроны и протоны в ЦПЭ, по которой они передаются на О2. Окислительное декарбоксилирование пирувата Окислительное декарбоксилирование пирувата происходит в матриксе митохондрий. Превращение пирувата в ацетил-КоА описывают следующим суммарным уравнением: СН3-СО-СООН + NAD+ + HSKoA → CH3-CO ∼SKoA + NADH + H+ + CO2 В ходе этой реакции происходит окислительное декарбоксилирование пирувата, в результате которого карбоксильная группа удаляется в виде СО2, а ацетильная группа включается в состав ацетил- КоА. Один атом водорода оказывается в составе NADH, а другой в виде Н+ поступает в среду. Реакция необратима. Процесс окислительного декарбоксилирования пирувата катализирует сложноорганизованный пируватдегидрогеназный комплекс. В пируватдегидрогеназный комплекс (ПДК) входят 3 фермента: пируватдекарбоксилаза, дигидролипоилтрансацетилаза и дигидролипоилдегидрогеназа, а также 5 коферментов: тиаминдифосфат (ТДФ), липоевая кислота,. FAD, NAD+ и КоА.
Окислительное декарбоксилирование пирувата сопровождается образованием NADH, поставляющим электроны в дыхательную цепь и обеспечивающим синтез 3 молей АТФ на 1 моль пирувата путём окислительного фосфорилирования. Так как отношения АДФ/АТФ и NADH/NAD+ в клетке относительно постоянны, ускорение утилизации АТФ приводит к повышению концентрации АДФ и ускорению окисления NADH в дыхательной цепи. Повышение концентрации NAD+, в свою очередь, стимулирует окислительное декарбоксилирование пирувата. Напротив, повышение концентрации АТФ и NADH снижает скорость этого процесса. Таким образом, изменения отношений АДФ/АТФ и NADH/ NAD+ - важнейшие сигналы, отражающие энергетические потребности клетки и регулирующие скорость окислительного декарбоксилирования пирувата. Каталитическая активность пируват-дегидрогеназного комплекса снижается, когда в клетках имеется достаточно "топлива" в виде жирных кислот и ацетил-КоА. Реакции цикла трикарбоновых кислот Цикл реакций окисления активированного ацетильного остатка до углекислого газа получил название цикла трикарбоновых и дикарбоновых кислот, так как именно эти кислоты являются его главными компонентами. Специфический цикл превращений открывается образованием лимонной кислоты (цитрата), поэтому его называют ещё циклом лимонной кислоты или цитратным циклом. По имени первооткрывателя он носит название цикла Кребса. Г. Кребс (лауреат Нобелевской премии) определил последовательность реакций окисления ацетильных групп, образовавшихся из углеводов, жиров и аминокислот. ЦТК является конечным путём окислительного катабализма всех видов биомолекул, которые в аэробных условиях превращаются в ацетил-КоА, либо в промежуточные соединения цикла Кребса, а затем – в конечные продукты – углекислый газ и воду (схема 1). Исключительно важную роль ЦТК играет в энергетическом обмене. В этом процессе образуются первичные доноры водорода для дыхательной цепи митохондрий, которые окисляются НАД+ или ФАД-зависимыми дегидрогеназами, передающими водород в цепь переноса электронов, где происходит трансформация энергии электронов окисляемых субстратов в энергию макроэргических связей АТФ. ЦТК выполняет роль единого интегрального механизма взаимосвязи процессов клеточного метаболизма. Наряду с катаболическими функциями ЦТК выполняет анаболические функции: поставляет промежуточные метаболиты для реакций биосинтеза, например, сукцинил-КоА – для синтеза гемма, кетоглутарат – для синтеза глутаминовой кислоты и др. Таким образом, ЦТК относится к амфиболическим путям метаболизма. В условиях организма окисление ацетильного остатка происходит в несколько этапов, образующих циклический процесс. Все реакции цикла трикарбоновых кислот протекают в матриксе митохондрий. Образование цитрата В первой реакции цикла углеродный атом метильной труппы ацетил-КоА связывается с карбонильной группой оксалоацетата; одновременно расщепляется тиоэфирная связь и освобождается коэнзим A. Ацетилкофермент-А конденсируется с молекулой щавелевоуксусной кислоты (оксалоацетатом) с образованием лимонной кислоты под действием катализатора - цитратсинтетазы: СН3 СООН СООН | | | С=О + С=О + Н2О → СН2 + КоА-S-Н | | | S-КоА СН2 НО-С-СООН | | СООН СН2 | СООН Эта реакция необратима и является лимитирующей для цикла ЦТК. 2. Превращение цитрата в изоцитрат Вторая реакция цитратного цикла - обратимое превращение цитрата в изоцитрат. Фермент, катализирующий эту реакцию, назван аконитазой по промежуточному продукту, цис-аконитовой кислоте, которая образуется в реакции. Однако это соединение не обнаруживается в свободном виде, так как не отделяется от активного центра фермента до завершения реакции. СООН СООН СООН | | | СН2 СН2 СН2 | | + Н2О | НО-С-СООН → С=СН-СООН → Н-С-СООН | - Н2О | | СН2 СООН Н-С-ОН | | СООН СООН 3. Окислительное декарбоксилирование изоцитрата Эту реакцию катализирует изоцитратдегидрогеназа. Реакция, катализируемая NAD-зависимой изоцитратдегидрогеназой. Активаторами фермента являются ионы магния или марганца и АДФ). Это медленная стадия, лимитирующая скорость цикла: СООН СООН | | СН2 СН2 | изоцитратдегидрогеназа | Н-С-СООН + НАД+ → СН2 + НАДН + Н+ + СО2 | | Н-С-ОН С=О | | СООН СООН 4. Окислительное декарбоксилирование α-кетоглутарата В этой реакции α-кетоглутарат подвергается окислительному декарбоксилированию с образованием в качестве конечных продуктов сук-цинил-КоА, СО2 и NADH + Н+. В результате этой реакции образуется высокоэнергетическое соединение сукцинил-КоА. Реакцию катализирует α-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс, который по структуре и функциям сходен с пируватдегидрогеназным комплексом. СООН СООН | | СН2 СН2 | кетоглутаратдегидрогеназа | СН2 + Н-S-КоА + НАД+ → СН2 + НАДН + Н++ СО2 | | С=О С=О | | СООН S-КоА 5. Превращение сукцинил-КоА в сукцинат Сукцинил-КоА - высокоэнергетическое соединение. В митохондриях разрыв тиоэфирной связи сукцинил-КоА сопряжён с реакцией фосфорилирования гуанозиндифосфата (ГДФ) до гуанозинтрифосфата (ГТФ). Эту сопряжённую реакцию катализирует сукцинаттиокиназа. С ГТФ концевая фосфатная группа может переноситься на АДФ с образованием АТФ; эту обратимую реакцию катализирует нуклеозид-дифосфаткиназа. ГТФ + АДФ ↔ ГДФ + АТФ. Образование высокоэнергетической фосфоангидридной связи за счёт энергии субстрата (сукцинил-КоА) - пример субстратного фосфорилирования: СООН СООН | | СН2 СН2 | сукцинл-КоА-синтетаза | + ГТФ + НS-КоА СН2 + ГДФ + Н3РО4 → СН2 | | С=О СООН | S-КоА сукцинат 6. Дегидрирование сукцината Образовавшийся на предьщущем этапе сукцинат превращается в фумарат под действием сукцинатдегидрогеназы. Этот фермент - флавопротеин, молекула которого содержит прочно связанный кофермент FAD. СООН СООН | | СН2 СН | сукцинатдегидрогеназа || СН2 + ФАД → СН + ФАДН2 | | СООН СООН 7. Образование малата из фумарата Образование малата (яблочной кислоты) происходит при участии фермента фумаратгидратазы (фумаразы). Фумаразу относят к ферментам с абсолютной субстратной специфичностью: она катализирует гидратацию только транс-формы фумарата. СООН СООН | | СН СН2 || фумаратгидратаза | СН + Н2О → НО-С-Н | | СООН СООН 8. Дегидрирование малата В заключительной стадии цитратного цикла малат дегидрируется с образованием оксалоацетата. Реакцию катализирует NAD-зависимая малатдегидрогеназа, содержащаяся в матриксе митохондрий. Равновесие малатдегидрогеназной реакции сильно сдвинуто влево. Тем не менее, эта реакция идёт слева направо, потому что продукт реакции, оксалоацетат, активно используется в цитратсинтазной реакции. СООН СООН | | СНОН С=О | малатдегидрогеназа | СН2 + НАД+ → СН2 + НАДН + Н+ | | СООН СООН Образованием оксалоацетата завершается один оборот цитратного цикла. В одном обороте цикла лимонной кислоты в 2 реакциях декарбоксилирования (превращение изоцитрата в α-кетоглутарат и α -кетоглутарата в сукцинил-КоА) происходит образование 2 молекул СО2. В 4 реакциях цитратного цикла происходит дегидрирование с образованием восстановленных коферментов: 3 молекул NADH+H+ и 1 молекулы FADH2. Суммарный материальный баланс ЦТК выглядит следующим образом: CH3CO-КоА + 3НАД+ + ФАД + ГДФ + Н3РО4 + Н2О → 2СО2 + 3 НАДН∙Н+ + ФАДН2 + ГТФ + HS-КоА Такая стехиометрия обусловлена следующими реакциями: 1. В цикл включаются два атома углерода, а покидают его два других. 2. Четыре пары атомов водорода покидают ЦТК. Две молекулы НАД восстанавливаются в реакциях окислительного карбоксилирования изоцитрата и оксоглутарата. Одна молекула ФАД восстанавливается при окислении сукцината и одна молекула НАД восстанавливается при окислении малата. Баланс АТФ в ЦТК Восстановленные коферменты (3 молекулы NADH∙Н+ и 1 молекула FADH2), образованные в цикле лимонной кислоты, отдают электроны в ЦПЭ на кислород - конечный акцептор электронов. Восстановленный кислород взаимодействует с протонами с образованием воды. На каждую молекулу NADH при образовании молекулы воды в процессе тканевого дыхания синтезируются 3 молекулы АТФ, а на каждую молекулу FADH2 - 2 молекулы АТФ. Всего в цикле Кребса при окислении НАДН и ФАДН2 в дыхательной цепи при переносе электронов на молекулярный кислород образуется одиннадцать молекул АТФ. Сам кислород не участвует в ЦТК, но цикл функционирует только в аэробных условиях, поскольку только в них могут быть регенерированы НАД и ФАД. Одна высокоэнергетическая связь регенерируется в виде ГТФ (равнозначно АТФ) из сукцинил-КоА в реакции субстратного фосфорилирования. Таким образом, за один оборот ЦТК образуется 12 молекул АТФ (3АТФ∙3 + 2 АТФ + 1АТФ), из них 11 макроэргических соединений - путём окислительного фосфорилирования, 1 – субстратного фосфорилирования. Непосредственное окисление ацетильного остатка протекает только в жестких условиях. Энергетический баланс полного аэробного окисления глюкозы  При аэробном расщеплении одной молекулы глюкозы клетка получает до 38 АТФ. При этом запасается 34,5х38 = 1311 кДж энергии. Всего выделяется 2872 кДж. КПД ЦТК - 45%. Регуляция пируватдегидрогеназного комплекса Регуляция на уровне ПДК имеет важное значение для обеспечения цитратного цикла "топливными" молекулами ацетил-КоА. Образование ацетил-КоА из пирувата - необратимый ключевой этап метаболизма. Животные не способны к превращению ацетил-КоА в глюкозу. Активность пируватдегидрогеназного комплекса регулируется различными способами: доступностью субстратов, ингибированием продуктами реакции, аллостерически и путём ковалентной модификации. Ковалентная модификация ПДК осуществляется фосфорилированием и дефосфорилированием. В состав ПДК входят 2 регуляторных субъединицы. Одна из них, киназа ПДК, фосфорилирует ПДК в определённых участках по остаткам серина. При фосфорилировании ПДК инактивируется. Другая регуляторная субъединица, фосфатаза, дефосфорилирует фермент, превращая его в активную форму. При повышении концентрации АДФ ПДК находится в нефосфорилированной активной форме. Этот эффект усиливается в некоторых клетках при повышении концентрации внутриклеточного Са2+, который активирует фосфатазу ПДК. Такой механизм активации ПДК особенно важен в мышцах и жировой ткани. Продукты пируватдегидрогеназной реакции (ацетил-КоА и NADH) аллостерически активируют киназу ПДК. Активированная киназа фос-форилирует и инактивирует ПДК. Таким образом, при накоплении NADH и ацетил-КоА тормозится превращение пирувата в ацетил-КоА. Такая ситуация создаётся, например, в печени при голодании: из жировых депо в печень поступают жирные кислоты, из которых образуется ацетил-КоА. В присутствии высокомолекулярных жирных кислот ингибирование ПДК усиливается. Пируват при этом не окисляется и может быть использован для синтеза глюкозы. Пируват аллостерически активирует нефосфорилированную форму ПДК, действуя согласованно с другими субстратами - NAD+ и КоА. Активация ПДК происходит также под влиянием инсулина. Один из эффектов инсулина - повышение концентрации внутримитохондриального Са2+. При повышении концентрации Са2+ ПДК активируется. Этот механизм особенно важен в жировой ткани, где ацетил-КоА необходим для синтеза жирных кислот. В клетках миокарда ПДК активируется адреналином, однако это влияние адреналина не связано с изменением концентрации цАМФ. Регуляция цитратного цикла Скорость синтеза АТФ строго соответствует энергетическим потребностям клетки. Это достигается согласованной регуляцией всех этапов заключительного пути катаболизма, включающего превращение пирувата в ацетил-КоА, цитратный цикл и ЦПЭ. Увеличение скорости утилизации АТФ для совершения различных видов работы увеличивает концентрацию АДФ, что ускоряет окисление NADH в ЦПЭ и, следовательно, повышает скорость реакций, катализируемых NAD-зависимыми дегидрогеназами. Окисление пирувата и ацетил-КоА может происходить только в том случае, если электроны и протоны от NADH и FADH2 поступают в ЦПЭ. Таким образом, отношения АДФ/АТФ и NADH/NAD+ - главные модуляторы скорости реакций общего пути катаболизма. Как известно, скорость метаболических путей, которые должны обеспечивать постоянный уровень конечных продуктов, таких, как АТФ, регулируется на уровне реакций, катализируемых регуляторными ферментами. На заключительном этапе катаболизма наиболее важные регуляторные ферменты - пируватдегадрогеназный комплекс, цитратсинтаза, изоцигратдегидрогеназа и α-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс. В большинстве случаев скорость реакций в метаболических циклах определяется их начальными реакциями. В ЦТК важнейшая регуляторная реакция - образование цитрата из оксалоацетата и ацетил-КоА, катализируемая цитратсинтазой. Эта реакция ускоряется при повышении концентрации оксалоацетата - субстрата реакции и тормозится продуктом реакции - цитратом. Когда отношение NADH/NAD+ снижается, скорость окисления маната в оксалоацетат возрастает. Повышение концентрации оксалоацетата ускоряет цитратсинтазную реакцию. Скорость реакции снижается при повышении концентрации АТФ, сукцинил-КоА и длинноцепочечных жирных кислот. Изоцитратдегидрогеназа аллостерически активируется АДФ и Са2+, которые присоединяются к ферменту в разных аллостерических центрах. В присутствии АДФ конформация всех субъединиц меняется таким образом, что связывание изоцитрата происходит значительно быстрее. Таким образом, при концентрации изоцитрата, которая существует в митохондриальном матриксе, небольшие изменения концентрации АДФ могут вызвать значительное изменение скорости реакции. Увеличение активности изоцитратдегидрогеназы снижает концентрацию цитрата, что, в свою очередь, уменьшает ингибирование цитратсинтазы продуктом реакции. При повышении концентрации NADH активность фермента снижается. α-Кетоглутаратдегидрогеназный комплекс, имеющий сходное строение с пируватдегидрогеназным, в отличие от последнего, не имеет в своём составе регуляторных субъединиц. Главный механизм регуляции α-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса - ингибирование реакции NADH и сукцинил-КоА. α-Кетоглутаратдегидрогеназный комплекс, как и Изоцитратдегидрогеназа, активируется Са2+, а при повышении концентрации АТФ скорости обеих реакций снижаются. В регуляции цитратного цикла существует множество дополнительных механизмов, обеспечивающих необходимый уровень метаболитов и их участие в других метаболических путях. Компартментализация ферментов, участвующих в реакциях окислительного декарбоксилирования пирувата и цикла лимонной кислоты, играет важную роль в регуляции этих процессов. Внутренняя мембрана митохондрий непроницаема для анионов и катионов, в том числе и для промежуточных продуктов цитратного цикла, которые могут быть перенесены через мембрану только при участии специальных белков. Поэтому ферменты цитратного цикла имеют больше возможностей для взаимодействия с продуктами предыдущих реакций, чем в случае свободного удаления этих продуктов из митохондрий. Доступность субстратов возрастает также в результате образования ферментных комплексов. Малатдегидрогеназа и цитратсинтаза образуют непрочные комплексы, в которых цитратсинтаза может использовать оксалоацетат, непосредственно образующийся малатдегидрогеназой. В ПДК и α-кетоглутаратдегидрогеназном комплексе субстраты непосредственно передаются от одного фермента к другому.  Регуляция общего пути катаболизма. 1 - ПДК активируется пируватом, NAD+, КоА; ингибируется NADH и ацетил-КоА; 2 - цитратсинтаза (реакция ускоряется при повышении концентрации оксалоацетата и замедляется при повышении концентрации цитрата, NADH, АТФ и сукцинил-КоА); 3 - изоцитратдегидрогеназа аллостерически активируется АДФ, ионами кальция, ингибируется NADH; 4 - α-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс ингибируется NADH, АТФ и сукцинил-КоА, а активируется ионами кальция. Анаболические функции цитратного цикла Цикл лимонной кислоты - один из амфиболических путей метаболизма. В нём осуществляются не только окислительные превращения энергетических субстратов до конечных продуктов СО2 и Н2О, но и происходит образование субстратов для других метаболических путей. Некоторые промежуточные продукты цикла лимонной кислоты: α-кетоглутарат, сукцинат, оксалоацетат могут использоваться для синтеза заменимых аминокислот. Убыль промежуточных продуктов цикла восполняется в реакциях, катализируемых специфическими ферментами. В нормальных условиях реакции, отвлекающие промежуточные продукты из цикла и восполняющие их убыль, находятся в состоянии динамического равновесия, так что концентрация этих продуктов в митохондриях остаётся постоянной. Реакции, обеспечивающие пополнение фонда промежуточных продуктов ЦТК, называются анаплеротическими (пополняющими). Важнейшая из них - реакция синтеза оксалоацетата из пирувата. Эту реакцию катализирует митохондриальный фермент - пируваткарбоксилаза.  Использование метаболитов ЦТК в синтезе различных соединений. Синтез заменимых аминокислот (1, 2, 3), глюкозы (4, 5, 6), жирных кислот (7), гема (8). |