Основы биологической химии предисловие

• Название: Основы биологической химии предисловие
• Анкор: Biokhimia.doc
• Дата: 20.05.2017
• Размер: 7.85 Mb.
• Имя файла: Biokhimia.doc
• Тип: Документы; #8022
• страница: 7 из 15

Глава 6. Ферменты

Как известно, важнейшим свойством любого живого организма является обмен веществ, ключевую роль в процессах которого играют ферменты или энзимы, которые по образному выражению И.П. Павлова, есть истинные двигатели всех жизненных процессов.

Ферменты - это катализаторы белковой природы, вырабатывае­мые живой клеткой и ускоряющие протекание химических реакций внутри самой клетки и, будучи извлеченными из нее, вызывают те же реакции вне организма.

Ферменты обеспечивают осуществление таких важнейших про­цессов жизнедеятельности, как реализация наследственной информа­ции, биоэнергетика, синтез и распад биомолекул. Этим объясняется особое внимание, уделяемое исследованию ферментов.

Учение о ферментах (энзимология) традиционно занимает ве­дущее место в биохимии, а сами ферменты являются наиболее изучен­ным типом белков. Многие свойства, характерные для всех белков, вна­чале были изучены на ферментах. Изучение ферментов имеет огромное значение для любой фундаментальной и прикладной области биологии, а также для многих отраслей химической, пищевой и фармацевтической промышленности, занятых приготовлением катализаторов, антибиоти­ков, витаминов и других биоактивных веществ.

6.2. Химическая природа и структура ферментов

Подобно другим белкам ферменты имеют большую молекуляр­ную массу - от десятков тысяч до нескольких миллионов дальтон и че­тыре уровня структурной организации: первичный, вторичный, третичный и четвертичный. Большинство ферментов обладают четвертичной структурой.

По своему строению ферменты, как и все белки, делят на про­стые (ферменты-протеины) и сложные (ферменты-протеиды, или холоферменты). Холоферменты состоят из белковой части - апофермента и небелковой - кофактора. Различают две группы кофакторов: ионы; ме­таллов и коферменты, представляющие собой низкомолекулярные орга­нические вещества. Небелковый компонент - кофактор в сложных фер­ментах, как правило, составляет незначительную часть от всего фер­мента. Следует отметить, что апофермент и кофактор порознь мало активны или вообще неактивны, только их комплекс - холофермент проявляет каталитические свойства.

Примерами простых ферментов являются пепсин, трипсин, па­паин, уреаза, лизоцим, рибонуклеаза, фосфатаза и другие. Большинство природных ферментов - сложные белки.

В трехмерной структуре и простых, и сложных ферментов с функциональной точки зрения различают ряд участков, среди которых главными являются активный центр и аллостерический (регуляторный) центр.

Активный центр - участок, с которым связывается субстрат (ве­щество, превращающееся под действием фермента). Обычно активный центр фермента образуют 12-16 остатков аминокислот, в состав активно­го центра холофермента входит также кофактор. В активном центре раз­личают контактный участок, связывающий субстрат, и каталитический участок, где происходит превращение субстрата после его связывания. Однако это деление условно, так как связывание субстрата в контактном участке влияет на специфичность и скорость превращения его в катали­тическом участке. У простых ферментов роль функциональных групп кон­тактного и каталитического центра выполняют только боковые радикалы аминокислот. У сложных ферментов главную роль в этих процессах вы­полняют кофакторы. Они могут быть или прочно связаны с активным центром фермента, или могут легко отделяться от него при диализе. В первом случае кофакторы часто называют простетической группой, по­добно тому, как это принято для небелковой части неферментных белков. Но абсолютной разницы между простетической группой и кофактором нет, так как одни и те же соединения или ионы металлов могут быть и кофактором, и простетической группой в различных ферментах.

Кроме активного центра у ферментов имеется регуляторный, или аллостерический центр, который пространственно разделен с активным центром. Аллостерическим (от греческого alios - иной, чужой) он называ­ется потому, что молекулы, связывающиеся с этим центром, по строению (стерически) не похожи на субстрат, но оказывают влияние на связыва­ние и превращение субстрата в активном центре, изменяя его конфигу­рацию. Молекула фермента может иметь несколько аллостерических цен­тров.
6.3. Кофакторы ферментов

Ионы металлов как кофакторы ферментов

Примерно треть всех известных ферментов является металлозависимыми. Роль металлов в этих ферментах различна. Металлоферменты делятся на следующие группы и подгруппы:

1. Ферменты, где ионы металлов выполняют роль активаторов (эти ферменты катализируют и без металла, но их активность снижается).

2. Ферменты, где ионы металлов выполняют роль кофактора (без ионов металлов эти ферменты неактивны):

2.1) диссоциирующие металлоферменты - (ион металла легко диссоциирует от апофермента);

2.2) недиссоциирующие металлоферменты - металлопротеиды:

В роли кофактора могут выступать ионы различных металлов, чаще всего это ионы Mg²⁺, Мп²⁺ ,Zn²⁺, Fe²⁺, Сu²⁺, Са²⁺, Со²⁺, Мо⁶⁺ , K⁺.

Существует несколько вариантов участия ионов металла в работе фермента. В большинстве случаев ноны металлов вступают в непрочную связь с апоферментом, способствуя формированию каталитически активной третичной и четвертичной структуры апофермента. Стабилизация возможна за счет образования солевых мостиков между ионом металла и карбококсильными группами кислых аминокислот при формировании третичной структуры или между субъединицами при образовании четвертичной структуры. К числу таких ионов относятся Mg²⁺, Мn²⁺ , Zn²⁺, Са²⁺ и другие. Например, ионы кальция стабилизируют третичную и четвертичнyю структуры α-амилазы, а ионы цинка - алкогольдегидрогеназы; макромолекулы этих ферментов в ре­зультате становятся устойчивыми по отношению к пептигидролазам желудочно-кишечного тракта.

В составе металлопротеидов содержатся, как правило, металлы с переменной валентностью (железо, медь, кобальт, молибден). Наибо­лее многочисленны металлопродеиды класса оксидоредуктаз (катализ реакций окисления - восстановления). Ионы металлов в этих ферментах сами участвуют в транспорте электронов, то есть выполняют функцию каталитического участка. Классическим примером ферментов этого типа служат цитохромы (см. главу 9).

Наконец, многие ионы металлов (Mg²⁺, Мn²⁺ , Zn²⁺ и другие) активно участвуют в ферментативном катализе, связывая либо субстрат и фермент, либо кофермент с апоферментом. Примером первого случая может служить образование тройного фермент - металл - субстратного комплекса при действии аргиназы, петигидролаз, карбоксилаз и дру­гих ферментов. Примером второго рода является присоединение флавинового кофермента к апоферменту с помощью ионов железа, молиб­дена, меди и цинка.

Коферменты

Многие коферменты являются производными витаминов и витаминоподобных веществ, табл.7 (см. главу 7). Поэтому недостаточное по­ступление витаминов с пищей сразу сказывается на синтезе коферментов, и, как следствие, нарушаются функции соответствующих ферментов и обмен веществ в целом.

Таблица 7. Важнейшие коферменты и витамины, входящие в их состав

Кофермент	Основная функция	Витамин
1	2	3
Коферменты дегидрогеназ: 1.Никотинамидадениндинуклеотид (НАД) 2.Никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ) 3. Флавинадениндинуклеотид (ФАД) 4.Флавиномононуклеотид (ФМН)	Перенос водорода (электронов и протонов)	Витамин РР (никотиновая кислота, никотинамид) Витамин В2 (рибофлавин)
1	2	3
Кофермент аминофераз - пиридоксальфосфат	Перенос аминогрупп	Витамин В6 (пиридоксин)
Кофермент ацилирования (КоА, Коэнзим А)	Перенос ацильных групп	Пантотеновая кислота
Кофермент Q (KoQ коэнзим Q убихинон	Перенос протонов и электронов	Убихинон
Липоевая кислота	Декарбоксилирование α-кетокислот	-
Тиаминпирофосфат	Декарбоксилирование α-кетокислот	Витамин В1 (тиамин)
Тетрагидрофолиевая кислота (ТГФК)	Перенос одноуглеродных групп	Фолиевая кислота
Биоцитин (биотин)	Перенос СО2	Биотин
Гем	Перенос электронов	-
Кобаламины	Перенос алкильных групп, реакции изомеризации	Витамин В12 (цианкобаламин)

Существует менее многочисленная группа коферментов, назы­ваемых невитаминными. Этопроизводные нуклеотидов, моносахаридов, металлопорфиринов и некоторых пептидов.

Реакция образования холофермента Обратима:

кофермент + апофермент <=> холофермент.

В условиях живой клетки это равновесие иногда сильно смещено влево, и кофермент присоединяется к апоферменту вместе с субстратом в момент реакции. Другой крайний случай - стабильные холоферменты, содержа­щие прочно связанный кофермент, который в данном случае можно на­звать простетической группой. Такие ферменты являются сложными бел­ками. Необходимое и самое важное условие образования холофермента состоит в том, что структура кофермента должна быть комплементарна центру связывания апофермента.

6.4. Механизм действия ферментов

Механизм действия ферментов-протеидов и ферментов-протеинов однотипен и заключается в том, что ферменты ускоряют био­химическую реакцию за счет понижения ее энергии активации (рис 15).

По современным представлениям в ходе ферментативной реак­ции выделяют ряд этапов:

1) диффузия молекулы субстрата к ферменту и стерическое свя­зывание его с активным центром фермента;

2) преобразование первичного промежуточного комплекса в один или более активированный фермент;

3) отделение конечных продуктов реакции от фермента и диф­фузия их в окружающую среду.

Ход реакции	Ход реакции
а)	б)

Рис.15. Схемы реакций анаболизма (синтеза сложных молекул из более простых): а - реакция без участия фермента; б - реакция с участием фермента С - энергия; А···В - промежуточный комплекс; F···А···В - активированный фермет-субстратный комплекс; ΔН - тепловой эффект реакции, не зависит от участия катализатора

Как видно из представленных схем, введение в химическую сис­тему фермента способствует значительному понижению энергии актива­ции реакции и тем самым обусловливает возрастание скорости реакции.

Для реакции катаболизма (расщепление сложных молекул на простые компоненты): АВ → А + В можно составить следующие схемы:

a)AB + F → ABF;

б) ABF→ А + BF; (а+б+в): АВ + F → ABF → А + В + F.

в) BF → В + F;
6.5. Свойства ферментов

Ферменты, как и неферментные катализаторы, характеризуются следующими сходными свойствами:

1. Они остаются неизменными после реакции и могут вновь реа­гировать с новыми молекулами субстрата (хотя активность их может из­мениться под влиянием условий среды) до тех пор, пока по каким-либо причинам не разрушатся.

2. Они оказывают свое действие в ничтожно малых концентра­циях.

3. Они лишь повышают скорость реакции и не оказывают влияния на величину константы равновесия.

4. Они катализируют только энергетически возможные реакции.

Однако ферменты, являясь белками, имеют следующий ряд свойств, отличающийся от свойств небиологических катализаторов.

1. Ферменты "работают" в очень мягких условиях (низкая температура – температура тела, нормальное давление, близкое к нейтральному значению рН). Будучи белками, они очень чувствительны к сдвигам рН и к изменениям температуры, т.е. термолабильны.

2. Скорость ферментного катализа гораздо выше, чем небиологического, т.е. ферменты сильнее снижают энергию активации реакции, чем другие катализаторы, Так, например, гидролиз белка до аминокислот под действием неорганических катализаторов (кислот или щелочей) осуществляется при температуре 100° С и выше за несколько десятков часов. Этот же процесс при каталитическом участии ферментов (например, пепсина или трипсина) требует всего десятков минут и идет при температуре 30-40 °С. Другой пример: в организме человека ежесуточно распадается около 0,5 кг глюкозы до СО₂ и Н₂О; в отсутствии биокатализаторов для этого потребовалось бы примерно 10000 лет. Благодаря каталитическому действию ферментов, в живой природе с большей скоростью происходят реакции, выполнение которых в лабораторных условиях остается пока еще невозможным.

3. Ферменты обладают высокой специфичностью, что позво­ляет ферментам направлять обмен веществ в определенное русло.

4. В отличие от небиологических катализаторов активность ферментов можно регулировать. Это уникальное свойство ферментов позволяет изменять скорость превращения веществ в организме в зависимости от условий среды, т.е. приспосабливаться к действию различных факторов.

5. Скорость ферментативной реакции в отличие от небиологического катализа прямо пропорциональна концентрации катализато­ра-фермента.

Остановимся на некоторых свойствах ферментов более подробно.
6.6. Специфичность действия ферментов

Специфичность – главное и особое качество ферментов, отличающее их от других катализаторов. Сущность этого свойства заключа­ется в том, что каждый фермент катализирует химическое превращение определенных веществ.

Структура активного центра фермента комплементарна струк­туре его субстрата, вследствие чего данный фермент из множества ве­ществ, имеющихся в живой клетке, присоединяет только свой субстрат.

Это свойство называется субстратной специфичностью фермента. Напри­мер, структура активного центра фермента гистидазы комплементарна структуре аминокислоты гистидина, поэтому возможно образование фер­мент-субстратного комплекса гистидаза-гистидин; другие вещества, в том числе аминокислоты, не связываются гистидазой. Каждый фермент ката­лизирует лишь одно из возможных химических превращений субстрата. Это свойство называется специфичностью пути превращения. Например, гистидаза и гистидиндекарбоксилаза, обладая одинаковой субстратной специфичностью, катализируют разные превращения гистидина.

Субстратная специфичность бывает абсолютной и групповой. Абсолютная специфичность означает, что фермент катализирует пре­вращение только одного субстрата. Например, фумараза катализирует только реакцию фумаровой кислоты с водой:

Фумаровая кислота

Яблочная кислота

Ферменты с групповой специфичностью катализируют однотип­ные превращения сходных по строению веществ. Например, липаза уско­ряет гидролиз различных жиров на глицерин и жирные кислоты:

Жир

глицерин

жирные кислоты

Кроме того, некоторые ферменты являются стереоспецифичными, то есть катализируют превращение только одного из стереоизомеров.

Например, малеиновая кислота - цис-изомер фумаровой кислоты, не может быть субстратом фумаразы:

Фумаровая кислота

Малеиновая кислота

6.7. Факторы, влияющие на скорость ферментативного катализа

Скорость ферментативной реакции определяется количеством вещества, превращающимся в единицу времени, и зависит от температу­ры, рН среды, концентрации субстрата и фермента.

Скорость ферментативной реакции является мерой активности фермента. Активность фермента можно измерить только косвенно: по количеству превращаемого субстрата или получаемого продукта реакции в единицу времени.

Влияние температуры на активность ферментов

Зависимость каталитической активности от температуры (термолабильность) для большинства ферментов выражается типичной кривой, представленной на рис.16.



Рис. 16. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры

Скорость ферментативных реакций, как и любых других, при повышении температуры на каждые 10 °С увеличивается примерно в 2-4 раза (правило Вант-Гоффа), но это правило справедливо лишь в облас­ти температур до 50-60°С. При температуре выше 50°С начинается де­натурация фермента, что означает уменьшение его количества и соот­ветственно снижается скорость реакции. При температурах 80-100°С почти все ферменты утрачивают свою активность (исключение состав­ляет только один фермент мышечной ткани - миокиназа, который вы­держивает нагревание до 100°С). Оптимальной для действия ферментов животного происхождения является температура 40-50°С, а для расти­тельного - 50-60°С. Однако есть ферменты с более высокими оптималь­ными температурами, например, у папаина (фермента растительного происхождения, ускоряющего гидролиз белка) он равен 80°С. В то же время у каталазы (фермента, ускоряющего распад перекиси водорода до воды и О₂ ) оптимальная температура действия находится между 0 и 10°С, а при более высоких температурах происходит инактивация фер­ментов. При температурах 0°С и ниже большинство ферментов не раз­рушается, но их активность стремится к нулю.

Свойство термолабильности ферментов имеет важное значение для понимания процессов жизнедеятельности. При снижении температуры некоторые животные впадают в состояние спячки или анабиоза. При этом скорость ферментативных процессов уменьшается, что снижа­ет расход накопленных организмом питательных веществ и замедляет обмен веществ. Искусственное охлаждение организма (гибернация) ис­пользуется в клинике для проведения хирургических операций.

Влияние рН на активность ферментов

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентра­ции водородных ионов носит колоколообразный характер (рис. 17). Ка­ждый фермент имеет свой оптимум рН среды, при которой он макси­мально активен. Большинство ферментов имеет максимальную актив­ность при физиологическом значении рН среды 6,0-8,0, однако некото­рые ферменты хорошо работают или в кислой (пепсин), или в щелочной (аргиназа) среде. В табл. 8 приведены оптимумы рН ряда ферментов.

Влияние изменения рН среды на молекулу фермента состоит в изменении степени ионизации кислотных и основных групп активного центра фермента, что сказывается на третичной структуре белка и со­ответственно на формировании активированного фермент-субстратного комплекса. Кроме того, имеет значение состояние ионизации субстрата и кофермента.

Таблица 8

Оптимальное значение рН для некоторых ферментов

Название фермента	Катализируемая реакция	рН
Пепсин	Гидролиз белка	1,5-2,5
Липаза (из семян клещевины)	Гидролиз жиров	4,7-5,0
Каталаза	Разложение перекиси	6,8-7,0
Уреаза	Гидролиз мочевины	7,0-7,2
Трипсин	Гидролиз белка	7,5-8,5
Аргиназа	Гидролиз аргенина	9,5-10,0

Рис. 17. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН среды

Значение оптимумов рН для разных ферментов важно для прак­тической медицины. Например, пепсин, гидролизующий белки в желудке, активно работает только в сильнокислой среде (см. табл.8). Поэтому для восстановления нарушенной активности эндогенного пепсина необходи­мы вещества, повышающие кислотность. Так, препарат пепсина прини­мают с соляной кислотой, создающей нужный рН.

Влияние концентраций субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата носит гиперболический характер (рис. 18). При постоянной концентрации фермента скорость реакции постепенно увеличивается достигая максимума; когда дальнейшее увеличение концентрации субстрата уже не влияет на скорость реакции, в этом случае говорят, что фермент насыщен, а субстрат в избытке.

Зависимость скорости реакции от концентрации фермента (рис.18) является прямо пропорциональной; чем больше концентрация фермента, тем выше скорость реакции.

а)

б)

Рис. 18. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации: а - субстрата; б - фермента

Зависимость скорости реакции от времени

Как известно, скорость любой химической реакции (активности фермента) уменьшается со временем (рис.19). Уменьшение скорости ферментативной реакции во времени может быть связано с рядом при­чин:

- уменьшение концентрации субстрата;

- увеличение скорости обратной реакции;

- ингибирование фермента продуктом реакции;

-денатурация фермента.



Рис.19. Зависимость скорости ферментативной реакции от времени ([Р] и [S] - концентрации продукта и субстрата)
6.8. Регуляция активности ферментов

Регуляция активности ферментов может осуществляться путем взаимодействия с ними различных эндогенных биоактивных соединений или чужеродных веществ (например, лекарств и ядов).

Под действием одних регуляторов (активаторов) ферментатив­ная реакция может ускоряться, под действием других (ингибиторов) - замедляться.

Активация ферментов

В большинстве случаев активирующее действие на фермент оказывают вещества, влияющие на активный центр фермента. К тако­вым относятся кофакторы ферментов и субстраты. Таким образом, ко­факторы являются не только обязательными структурными компонента­ми ферментов-протеидов, но и их активаторами. Кроме ионов металлов и коферментов активирующее влияние могут оказывать предшественни­ки и активные аналоги коферментов, субстрат в известных пределах концентрации, некоторые органические и неорганические анионы. Так соляная кислота (анион СI^¯ ) активирует действие пепсина, желчные ки­слоты - действие панкреатической липазы.

Ингибирование ферментов

Ингибиторы - вещества, тормозящие действие ферментов. Раз­личают обратимое и необратимое ингибирование (инактивация). При­мерами необратимого ингибирования является действие солей тяжелых металлов, йодацетата, синильной кислоты и др.

В случае необратимого ингибирования молекула ингибитора вызывает стойкие, необратимые изменения или модификацию активного центра фермента. Чаще имеет место обратимое ингибирование, кото­рое, в свою очередь, делят на конкурентное и неконкурентное.

При конкурентном ингибировании ингибитор, обладая струк­турным сходством с субстратом, соединяется с ферментом, подменяя собой субстрат, конкурируя с ним. Так как часть фермента расходуется на образование комплекса фермент-ингибитор, то количество фермент-субстратного комплекса снижается, и падает скорость ферментативной реакции. Конкурентные ингибиторы, таким образом, подавляют актив­ность только одного фермента или группы ферментов со сходным ак­тивным центром. Механизм конкурентного ингибирования можно выра­зить следующей схемой:

F + S = FS = F + P;

F + I = FI,

где F - фермент; S - субстрат; I - ингибитор, Р - продукт.

Если повышать концентрацию субстрата, то доля комплекса FS увеличивается, а комплекса FI уменьшается. При достаточно высокой концентрации субстрата весь фермент будет в форме комплекса FS, и скорость реакции будет максимальной, несмотря на присутствие ингиби­тора.

В качестве примера конкурентного ингибирования рассмотрим торможение действия фермента холинэстеразы при помощи диизопропилфторфосфата, который является ингибитором также и других эстераз и пептидгидролаз, имеющих серии в активном центре.

Холинэстераза - фермент, каталитически ускоряющий гидролиз ацетилхолина на холин и уксусную кислоту:

Ацетилхолин

Уксусная кислота

Холин

Реакция идет с большой скоростью: одна молекула холинэстера­зы разлагает за одну минуту несколько миллионов молекул ацетилхоли­на. Этот процесс имеет огромное значение для нервной системы, так как ацетилхолин является промежуточным соединением в передаче нервного импульса. Действие холинэстеразы угнетается сильнейшим нервным ядом - диизопропилфторфосфатом, структура которого в некоторой части мо­лекулы подобна структуре ацетилхолина:

Ацетилхолин

диизопропилфторфосфат

К активному центру холинэстеразы вместо группировки

- ацетилхолина легко присоединяется группировка диизопропилфторфосфата: наступает торможение работы фермента со всеми вытекающими отсюда для организма последствиями.

Примером конкурентного ингибирования служит также торможе­ние сукцинатдегидрогеназы (СДГ) малоновой кислотой. Этот фермент катализирует окисление путем дегидрирования янтарной кислоты (сукцината) в фумаровую:



Малонат в результате структурного сходства с субстратом (сукцинат) реагирует с активным центром СДГ с образованием фермент–ингибитор -комплекса, однако при этом перенос водорода от малоната не происходит.

Метод конкурентного торможения нашел широкое применение в медицинской практике. Например, для лечения некоторых инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, применяют сульфаниламидные препараты. Эти препараты имеют сходство с парааминобензойной кисло­той, которую бактериальная клетка использует для синтеза фолиевой кислоты, являющейся составной частью ферментов бактерий. Благодаря этому структурному сходству, сульфаниламид блокирует действие фер­мента путем вытеснения параминобензойной кислоты из комплекса с ферментом, синтезирующим фолиевую кислоту, что ведет к торможению роста бактерий:

n-аминобензойная кислота

сульфаниламид

Некоторые аналоги витамина В₆ и фолиевой кислоты, например, дезоксипиридоксин и аминоптерин, действуют как конкурентные коферментные ингибиторы (или антивитамины), тормозящие многие биохими­ческие процессы в организме.

Неконкурентное ингибирование вызывается веществами, не имеющими структурного сходства с субстратами. При этом ингибитор влияет на каталитическое превращение, но не на связывание субстрата с ферментом. Неконкурентный ингибитор или связывается непосредст­венно с каталитическим участком активного центра, или, связываясь с ферментом в одном из аллостерических центров, изменяет конформацию активного центра таким образом, что затрагивает структуру ката­литического участка. Так как неконкурентный ингибитор не влияет на связывание субстрата, то в отличие от конкурентного ингибирования наблюдается образование тройного комплекса по уравнению

F + S +I→ FSI.

Однако превращения этого комплекса в продукты реакции не происхо­дит.

Примером неконкурентного ингибирования может служить бло­кирование ферментов ионами тяжелых металлов (Hg , As , Pb, Cd ), ко­торые присоединяются к сульфогидрильным (-SH) группам полипептидной цепи каталитического участка. Торможение солями синильной ки­слоты, угарным газом основано на том, что анионы СN¯ или молекулы СО прочно соединяются с трехвалентным железом, входящим в катали­тический участок геминового фермента - цитохромоксидазы. Блокада этого фермента выключает дыхательную цепь, и клетка погибает.

Снять действие неконкурентного ингибитора избытком субстра­та (как действие конкурентного) нельзя, а можно лишь веществами, связывающими ингибитор. Эти вещества называют реактиваторами.

Ионы тяжелых металлов лишь в небольших концентрациях яв­ляются неконкурентными ингибиторами. В больших концентрациях они выступают как инактиваторы (оказывают денатурирующее действие).

Неконкурентные ингибиторы применяются как фармакологиче­ские средства, отравляющие вещества для борьбы с вредителями сель­ского хозяйства и в военных целях.

Аллостерическая регуляций действия ферментов

Многие ферменты с четвертичной структурой могут обратимо связывать по месту аллостерического (регуляторного) центра некото­рые вещества, активирующие или ингибирующие фермент. Эти вещест­ва называют аллостерическими эффекторами, в качестве которых могут выступать различные метаболиты, гормоны, ионы металлов, коферменты и очень редко - молекулы субстрата. Аллостерический ингибитор, комплементарно соединяясь с регуляторным центром, меняет его конформацию, что влечет за собой изменение конформации и каталитиче­ского участка (активного центра). Аллостерический активатор, напро­тив, облегчает превращение субстрата в активном центре фермента.

В качестве примера аллостерической регуляции рассмотрим обратимое инактивирование фермента аденилатциклазы, катализирую­щей реакцию синтеза циклоаденозинмонофосфата (цАМФ) из АТФ по схеме:

АТФ → цАМФ + Н₄Р₂О₇

Эта реакция играет важную роль в системе регуляции передачи физио­логического сигнала из внеклеточной среды внутрь клетки. Аллостерическими эффекторами аденилатциклазы являются некоторые гормоны (адреналин, глюкагон и др.). Аденилатциклаза локализуется в плазма­тической мембране и состоит из трех субъединиц: рецептора гормона, ГТФ-связывающего белка и каталитической субъединицы. Рецептор, гормона ориентирован центром связывания на наружную поверхность мембраны, а каталитическая субъединица своим активным центром вы­ходит на внутреннюю сторону мембраны (рис.20).



Рис. 20. Регуляция действия аденилатциклазы: Р - рецептор гормона;

Г- ГТФ-связывающий белок; А- каталитическая субъединица аденилатциклазы

Когда рецептор гормона свободен, ГТФ-связывающий белок, соединен с ГДФ, и в этом состоянии системы аденилатциклаза неактивна. Когда к рецептору присоединяется гормон ГДФ в белке заменяется на ГТФ, и этот новый комплекс «ГТФ-белок» активирует аденилатциклазу - начи­нается синтез цАМФ, активирующего другие ферменты внутри клетки. Таким образом, гормон - первый и внешний, а цАМФ - второй и внутри­клеточный вестник сигнала. Активная аденилатциклаза усиливает, на­пример, распад гликогена (см. главу 10) и подавляет его синтез, вызыва­ет расслабление гладких мышц кровеносных сосудов и т.д.
6.9. Определение активности ферментов

В основе всех методов определения активности ферментов ле­жит положение, согласно которому активность ферментов определяется количеством превращенного субстрата при определенных стандартных условиях: концентрации субстрата, температуре и рН среды. При опреде­лении активности фермента следует не забывать о том, что она резко меняется при различных условиях реакции. Различные методы количест­венного определения активности ферментов основаны на следующих принципах:

1) определяется наименьшее количество ферментного препарата, способного за определенный промежуток времени и при определенных условиях расщепить требуемое количество субстрата;

2) определяется остаток субстрата после воздействия фермента и за­тем рассчитывается количество субстрата, расщепившегося под действием определенного количества фермента;

3) активность фермента обозначают по времени, в течение которого определенная навеска фермента катализирует превращение определен­ной доли субстрата в стандартных условиях (начальная концентрация субстрата, температура, рН среды).

Согласно правилам, рекомендованным в 1961 году Комиссией по ферментам Международного биохимического союза, за единицу фермен­та (Е) принимают такое его количество, которое катализирует превраще­ние 1 мкмоль вещества (субстрата) за 1 минуту. Число единиц фермента в тканях определяют по формуле:



Часто находят удельную активность фермента: она равна числу единиц фермента в образце, деленному на массу белка (в мг) в этом об­разце. Например, если в 1 грамме ткани печени содержится 140 единиц лактатдегидрогеназы и 200 мг белка, то удельная активность лактатдегидрогеназы в печени равна 140/200=0,7 (мкмоль/мин)/мг. Если имеется очищенный индивидуальный фермент, то можно измерить его молярную активность: она равна числу единиц фермента в образце, де­ленному на количество фермента в микромолях. Молярная активность указывает, сколько молекул субстрата превращается одной молекулой фермента за 1 минуту.

Для правильного определения активности фермента необходимо проводить его в стандартных условиях, которые устанавливаются для каждого фермента из предварительных кинетических исследований, и точно измерять изменение содержания субстрата или продукта реакции за определенный, отрезок времени.

Рекомендуется проводить определение активности фермента при температуре 25°С, оптимуме рН и концентрации субстрата, превышающей концентрацию насыщения.
6.10. Номенклатура и классификация ферментов

До 1961 года не существовало единого подхода к образованию названий ферментов. Исторически возникшие (тривиальные) названия ферментов строились либо по названию субстрата с изменением суффик­са на -аза (например, уреаза, гистидаза, аргиназа), либо по характеру действия, например, пепсин (от греческого «легкие» - пищеварение) или трипсин (от греческого «трипсис» - разжижаю) и так далее. В 1961 году на V Международном биохимическом конгрессе в Москве были разрабо­таны и утверждены правила рациональной номенклатуры ферментов.

Согласно этим правилам название фермента составляют из хи­мического названия субстрата и названия той реакции, которая осущест­вляется ферментом. Если данная реакция сопровождается переносом группы атомов от одного партнера (субстрата) к другому (акцептору), то в название фермента включают еще и химическое наименование акцеп­тора. Например, пиридоксальфермент, катализирующий реакцию переаминирования между L-аланином и 2-оксоглутаровой кислотой, должен называться L-аланин: оксоглутарат-аминотрансфераза:

L-аланин (субстрат, донор)

2-оксоглутаровая кислота (акцептор)

Пировиноградная кислота

Глутаминовая кислота

Названия ферментов по рациональной номенклатуре являются точными и содержательными, но очень длинными. Поэтому наряду с рациональными названиями до сих пор используются тривиальные на­звания ферментов.

Классификация ферментов основана на типе катализируемой ферментом реакции. Все ферменты делятся на шесть главных классов, каждый из которых имеет строго определенный номер. Классы разделе­ны на подклассы и далее на подподклассы.

Название класса указывает тип химической реакции, катализи­руемой ферментом. Подкласс уточняет действие фермента, указывая в общих чертах на природу химической группы субстрата, атакуемой ферментом. Подподкласс ещё более конкретизирует действие фермен­та, уточняя природу атакуемой связи субстрата или природу акцептора.

1. Оксидоредуктазы - ферменты, катализирующие окисли­тельно-восстановительные реакции. Среди оксидоредуктаз различаются дегидрогеназы, катализирующие перенос водорода (протонов и элек­тронов), и оксидазы, катализирующие окисление субстрата кислородом. К этому же классу относятся гемсодержащие ферменты каталаза и пероксидаза. Оксидоредуктазы очень распространенный класс, насчиты­вающий около 480 ферментов. Большую роль они играют в энергетиче­ских процессах. Название ферментов этого класса составляют по схеме: «донор: акцептор – оксидоредуктаза».

2. Трансферазы - ферменты, катализирующие реакции меж­молекулярного переноса различных атомов, групп атомов от одного субстрата (донора) к другому (акцептору). Сюда относятся аминотрансферазы, ацилтрансферазы, метилтрансферазы, фосфотрансферазы и другие. Трансферазы - примерно столь же обширный класс, как и окси­доредуктазы. Они участвуют в реакциях взаимопревращения различных веществ, синтезе мономеров, обезвреживании природных и чужеродных соединений. Названия ферментов этого класса строят следующим обра­зом: "донор: транспортируемая группа - трансферазы''.

3. Гидролазы - катализируют реакции расщепления внутримо­лекулярных связей с присоединением воды по месту расщепления:

А—В + Н-ОН →А—ОН + Н—В.

К гидролазам относятся эстеразы - катализирующие реакции гидролиза и синтеза сложноэфирных связей (липаза, холинэстераза); пептидазы, или пептидгидролазы (пепсин, трипсин, карбоксипептидаза), расщеп­ляющие пептидные связи; гликозидазы, гидролизующие гликозидные связи, и так далее. Класс гидролаз насчитывает около 460 ферментов.

Гидролазами являются пищеварительные ферменты, ферменты лизосом и других органоидов клетки, где они способствуют распаду биополимеров на мономеры. Тривиальное название этих ферментов образуется добав­лением к названию субстрата окончания - аза. Систематическое название получают по схеме: "субстрат - гидролаза".

4. Лиазы - катализируют разрыв связей С-О, С-С, C-N и обрати­мые реакции отщепления различных групп от субстратов негидролитиче­ским путем, в результате чего происходит образование двойной связи или присоединяются группы по месту двойной связи. Примеры лиаз - декарбоксилазы (отщепляют СООН - группу от карбоновых кислот); альдолазы (расщепляют связь С-С с образованием альдегида); гидратазы (присоединяют воду по двойной связи); дегидратазы (отщепляют молекулу воды с образованием двойной связи); амидин-лиазы (отщепляют аминогруппу) и другие.

Лиазы - менее распространенная группа ферментов (около 230), участвующие в реакциях синтеза и распада промежуточных продуктов обмена. Систематическое название составляется по схеме: "субстрат-лиаза". В тривиальных названиях указываются особенности участвующих в реакции групп атомов - карбоксилаза (присоединение карбоксильной группы), дегидратаза (отщепление молекулы воды).

5. Изомеразы - катализируют различные реакции изомериза­ции, которые можно разделить на две группы. Первая - реакции внутри­молекулярного переноса групп; вторая - внутримолекулярные окисли­тельно-восстановительные реакции. Первый тип реакций катализируют изомеразы, которые называют мутазами и которые являются внутримоле­кулярными трансферазами. Сюда относят внутримолекулярные трансфе­разы, переносящие ацильные, фосфорильные и другие группы. Напри­мер, фосфоглицеромутаза превращает 3-фосфоглицериновую кислоту в 2-фосфоглицериновую кислоту:



К первому типу относят также рацемазы и эпимеразы, действующие на амино- и оксикислоты; таутомеразы.

Второй тип реакции изомеризации катализируют внутримолеку­лярный перенос кислорода или водорода, обеспечивающие взаимопревращение альдоз и кетоз. Например, триозофосфатизомераза катализирует взаимопревра­щение диоксиацетонфосфата и глицеральдегидфосфата.



Изомеразы - небольшая группа ферментов (чуть более 80), иг­рающая важную роль в восстановлении биологической активности моле­кул. Название этих ферментов складывается в зависимости от типа реак­ции по схеме: "субстрат - изомераза".

6. Лигазы (синтетазы) - катализируют синтез органических веществ из двух исходных молекул с участием какого-либо нуклеозид-трифосфата, при распаде которого освобождается необходимая для син­теза энергия. Ферментов этого класса насчитывается около 80. Система­тическое название лигаз образуется по схеме: «Х:У-лигаза», где X и Y -исходные вещества. Например, L-глутамат: аммиак - лигаза (или триви­альное название глутаминсинтетаза).
6.11. Локализация ферментов в организме и клетке

Большинство ферментов обнаруживается во всех клетках орга­низмов. В плазме крови также содержатся ферменты, но их концентрация значительно ниже; чем в клетках. Ряд ферментов, необходимых для жиз­необеспечения и деления самих клеток, содержится в клетках всех орга­нов и тканей. Но наряду с такого рода ферментами в клетках различных органов и тканей встречаются специфические ферменты. Например, уроканиназа содержится только в печени, гистидаза - в печени и коже, креатинфосфокиназа - в мышечных клетках, ферменты, синтезирующие сте­роидные гормоны, вырабатываются только клетками коры надпочечников и так далее.

Клетка имеет сложное строение (рис. 21), в клетке любого орга­на и ткани можно обнаружить клеточную или плазматическую мембрану, ядро, митохондрии, лизосомы, рибосомы, систему канальцев и пузырьков - эндоплазматический ретикулум, пластинчатый комплекс, различные вакуоли, внутриклеточные включения и другие. Главную по массе не­дифференцированную часть цитоплазмы клетки составляет гиалоплазма, или цитозоль.



Рис. ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ

а. Растительные 10-100 мкМ; б. Животные 5-30 мкМ
Внутри клетки, ферменты содержатся как в растворимой части цитоплазмы, так и в субклеточных структурах. Принадлежность различ­ных ферментных систем определенным участкам клетки называется компартментализацией.

Установлено, что в ядре локализованы РНК - полимеразы, катализирующие образование мРНК; ферменты, участвующие в репли­кации ДНК, и некоторые другие.

В митохондриях находятся ферменты цепи биологического окисления (тканевого дыхания) и окислительного фосфорилирования; ферменты пируватдегидрогеназного комплекса, цикла трикарбоновых кислот и другие.

В лизосомах в основном содержатся гидролазы, оптимально действующие при рН =5.

В рибосомах обнаружены ферменты белкового синтеза, здесь происходит транслирование мРНК и связывание аминокислот в полипептидныё цепи с образованием молекул белка.

В эндоплазматической сети локализованы ферменты синтеза лилидов и ферменты реакций гидроксилирования.

Плазматическая мембрана содержит АТФ-азу, транспортирую­щую ионы Na⁺ и К⁺, аденилатциклазу и другие.

В цитозоле локализованы ферменты гликолиза, пентозофосфатного цикла, синтеза жирных кислот и мононуклеотидов, активирования аминокислот, ферменты глюконеогенеза.
6.12. Применение ферментов

Ферменты находят все более широкое применение в различных отраслях промышленности (хлебопечение, виноделие, сыроварение, пи­воварение, кожевенное и меховое производство, кулинария и так далее).

В настоящее время развивается новая отрасль - промышленная энзимология, которая использует выделенные из биологических объектов ферменты для получения продуктов питания из целлюлозы, нефти; син­теза ряда аминокислот, лекарственных препаратов; для создания про­мышленных штаммов микроорганизмов - источников витаминов и неза­менимых аминокислот и так далее.

Отдельной отраслью промышленной энзимологии является ме­дицинская энзимология, которая развивается по трем главным направле­ниям.

Первое - энзимопатология - исследует ферментативную актив­ность в норме и при патологии. Многие наследственные болезни, как ока­залось, являются следствием дефекта какого-либо фермента.

Второе направление - энзимодиагностика. Ферменты используют в качестве избирательных реагентов для определения содержания хими­ческих веществ в крови, желудочном соке, моче и других физиологиче­ских жидкостях. Кроме того, выявляют и определяют количественное содержание самих ферментов прежде всего в сыворотке крови при пато­логии. Полученные данные используют для диагностики болезней и для контроля эффективности лечения. Установлено, например, что при диабете, злокачественном поражении поджелудочной железы, болезнях печени резко увеличивается уровень липазы, амилазы, трипсина, химотрипсина. При инфаркте миокарда - повышается уровень аминотрансфераз, креатинкиназы и лактатдегидрогеназы и так далее. Из­менение содержания ферментов в клетках и за их пределами вследст­вие болезни называется энзимопатиями, которые бывают наследствен­ные и приобретенные.

Третье направление - энзимотерапия - использование фермен­тов в качестве лекарств. Например, при желудочных заболеваниях, со­провождающихся снижением содержания пепсина в желудочном соке, для улучшения пищеварения применяют пепсин и его производные. Нуклеазы используют при лечении некоторых вирусных заболеваний. Протеолитические ферменты используют очень часто для лечения тромбозов. Аспарагиназу применяют для лечения некоторых форм лей­козов. Она разрушает аспарагин, необходимый для роста лейкозных клеток и содержащийся в плазме крови; в результате лейкозные клетки погибают.

Таким образом, очевидно, что развитие медицинской этимоло­гии имеет огромнейшее значение для предупреждения, выявления и лечения различных заболеваний.