Лаб. практикум. Практикум по биологической химии методические указания к проведению лабораторных работ по биологической химии для студентов второго курса
 Скачать 1.02 Mb.
|
ФотоколориметрияПод колориметрией понимают метод определения низких концентраций веществ в окрашенных растворах по интенсивности окраски. В фотоколориметре интенсивность окраски оценивается по величине светопропускания. Концентрацию вещества в растворе определяют либо с помощью калибровочной кривой, либо по сравнению с оптической плотностью (экстинкцией) раствора с известной концентрацией. Построение калибровочных кривых. Количество вещества в пробе определяют с помощью калибровочного графика, отражающего зависимость между концентрацией раствора и его оптической плотностью. Для получения калибровочного графика готовят несколько растворов определяемого в биологическом объекте вещества с различными известными концентрациями, но пределах концентраций, в которых это вещество содержится в крови (моче), и с учетом изменения его содержания в сторону повышения или снижения при патологических состояниях. Нулевое значение устанавливают по раствору, приготовленному не содержащему исследуемое вещество, На миллиметровой бумаге откладывают по оси абсцисс величины концентрации белка в растворе, по оси ординат - соответствующее значение оптической плотности растворов. Проводят прямую через найденные точки и , пользуясь этим графиком находят концентрацию белка в сыворотке. Подготовка фотоколориметра к работе. 1.1. Колориметр включить в сеть за 15 минут до начала измерений. Во время прогрева кюветное отделение должно быть открыто. 1.2. Ввести необходимый по роду измерений цветной фильтр. 1.3. Установить минимальную чувствительность колориметра. Для этого ручку ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ установить в положение «1», ручку УСТАНОВКА 100 ГРУБО в крайнее левое положение. При измерении со светофильтрами 315, 364, 400, 440, 490, 540 нм отмеченными на лицевой панели колориметра черным цветом, ручку ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ устанавливать в одно из положений «1», «2», «3», отмеченных на лицевой панели также черным цветом. При измерении со светофильтрами 590, 670, 759, 870, 980 нм , отмеченными на лицевой панели колориметра красным цветом, ручку ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ устанавливать в одно из положений «1», «2», «3», отмеченных на лицевой панели красным цветом. 1.4. Рабочие поверхности кювет должны перед каждым измерением тщательно протираться спиртово-эфирной смесью. При установке кювет в кюветодержатели нельзя касаться пальцами рабочих участков поверхностей (ниже уровня жидкости в кювете). Наливать жидкость в кюветы до метки на боковой стенке кюветы. После смены светофильтра и при выдержке колориметра при открытой крышке кюветного отделения в течение длительного времени (более 5 мин) измерения начинать после пятиминутной засветки фотоприемника. 1.5. После завершения работ на колориметре до его выключения ручку ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ установить в положение «1», обозначенное красным цветом, а ручку УСТАНОВКА 100 ГРУБО – в крайнее левое положение, и только после этого выключить тумблер СЕТЬ колориметра. Измерение коэффициента пропускания. 2.1. В световой пучок поместить кювету с растворителем или контрольным раствором, по отношению к которому производятся измерения. 2.2.Закрыть крышку кюветного отделения. 2.3.Ручками ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ и УСТАНОВКА 100 ГРУБО и ТОЧНО установить отсчет 0 по шкале колориметра. Ручка ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ может находиться в одном из трех положений: «1», «2» или «3». 2.4. Затем поворотом ручки кювету с растворителем или контрольным раствором заменить кюветой с исследуемым раствором. 2.5. Снять отсчет по шкале колориметра, соответствующий коэффициенту пропускания исследуемого раствора в единицах оптической плотности. Разделение белков сыворотки методом электрофореза на бумагеВ клинических лабораториях наиболее распространены электрофоретические методы исследования белкового спектра плазмы (сыворотки) крови. Принцип метода. Метод основан на том, что под влиянием постоянного электрического поля белки сыворотки, обладающие электрическим зарядом, движутся по смоченной буферным раствором бумаге со скоростью, зависящей от величины заряда и молекулярного веса частиц. Вследствие этого белки сыворотки разделяются обычно на 5–7 фракций: альбумины и глобулины α1, α2, β и γ, содержание которых определяется фотометрически. Относительное содержание белковых фракций в сыворотке крови здорового человека выражается следующими цифрами: Альбумины – 52–65%; глобулины – 29–54%: α1-глобулины – 2-5%, α2-глобулины – 7-13%, β-глобулины – 8-14%, γ-глобулины – 12-22%. Исследуемый материал и реактивы 1. Сыворотка крови. 2. Буферный раствор. 3. Хроматографическая бумага. 4. Краситель амидо черный 10 В. 5. Раствор уксусной кислоты (2%). 6. Раствор гидроксида натрия (0,1н). Ход работы 1. Электрофоретическое разделение белков сыворотки крови. Полоска хроматографической бумаги пропитывается буферным раствором, концы полоски опускаются в кюветы с буферным раствором, а в кюветы помещают электроды — катод и анод. В средней трети бумажной полоски поперек на полосу на линию старта наносят исследуемую сыворотку и включают электрический ток. Через определенное время ток выключают и бумажку подсушивают при 900С (при этом белки подвергаются денатурации и фиксируются на бумаге). Далее фракции нужно проявить. 2. Окраска электрофореграмм. Фиксированные полосы помещают в кювету с краской (амидо черный 10 В) и оставляют там на 15–20 минут. Для удаления избытка краски бумажные полоски переносят в кювету с 2% раствором уксусной кислоты. Через 5–10 минут кислоту сливают и полоски заливают чистым раствором уксусной кислоты. В результате такой обработки синие пятна, соответствующие различным фракциям белков, отчетливо видны на белом фоне. Полученные электрофореграммы сушат на воздухе. 3. Количественная оценка электрофореграмм. В 5 пробирок наливают из бюретки по 5мл 0,1н. NаОН. Вырезают ножницами участки электрофореграммы, соответствующие каждой фракции, помещают в пронумерованные пробирки со щелочью. В качестве контроля берут неокрашенный участок бумажной полоски шириной 3–10 мм. Пробирки осторожно встряхивают и оставляют на 30–60 минут для полного извлечения краски из бумаги. Затем определяют оптическую плотность каждого раствора на фотоэлектроколориметре (кювета 10 мм, красный светофильтр с длиной волны = 670 нм). Зная оптические плотности растворов, соответствующие каждой фракции, вычисляют сумму оптических плотностей всех фракций и выражают относительное содержание белка в каждой фракции. Например:  Еальбум = , Еα1-глобул = , Еα2-глобул = , Еβ-глобул = , Еγ-глобул = , Σ = . % = , % = , % = , % = , % = . |