Медицинская микробиология и вирусология ч1 (1). Т. П. Гажеева, Т. Х. Гордеева, Е. И. Хорошавина Медицинская микробиология и вирусология Часть 1
 Скачать 5.4 Mb.
|
Методы изучения ферментативной активности бактерийПо биохимическим признакам бактерий исследуют их отношение к кислороду, ферментативную активность, способность расщеплять различные углеводы, накапливающиеся продукты метаболизма. Отношение к кислороду воздуха. По отношению к кислороду воздуха микроорганизмы делят на облигатные аэробы, факультативные анаэробы, облигатные анаэробы, микроаэрофилы, аэротолерантные. Об отношении бактерий к кислороду судят по росту культуры при посеве уколом в столбик с питательным агаром. Аэробы развиваются в верхней части укола, анаэробы – в нижней части, а факультативные анаэробы – равномерно по всему уколу. Сахаролитические свойства микроорганизмов, то есть способность разлагать сахара и многоатомные спирты с образованием кислоты, альдегида и газов (СО2 и Н2). Для обнаружения сахаролитических ферментов исследуемую культуру бактерий засевают в дифференциально- диагностические питательные среды (например, среда Гисса или «пестрый» ряд, состав: МПБ или пептонная вода, углеводы, индикатор Андреде. Среда Гисса содержит обычно ряд пробирок с углеводами: с глюкозой, лактозой, маннитом, мальтозой и сахарозой и др. Среды Гисса бывают жидкими и полужидкими (с добавлением 0,2–0,5% агар-агара). В пробирках с жидкими средами Гисса для обнаружения газов используется «поплавок» – трубочка диаметром 0,5-0,7 см, запаянная с одного конца. «Поплавок» помещают запаянным концом кверху; при стерилизации он полностью заполняется питательной средой. При образовании в среде газообразных продуктов они вытесняют часть жидкости, находящейся в «поплавке», вследствие чего у запаянного конца его собирается воздушный пузырек. В полужидких средах Гисса газообразование определяют по наличию мелких пузырьков газа в толще среды. Кроме того, сахаролитические свойства изучают на средах Эндо, Левина, Плоскирева идр элективных средах. Среда Эндо служит элективной и диагностической средой для группы кишечной палочки. В состав среды Эндо входит МПА, 1% лактоза, индикатор в виде основного фуксина, обесцвеченного сульфитом натрия (фуксин сернистая кислота). Микроорганизмы, содержащие фермент лактазу, ферментируют лактозу с образованием альдегидов, и фуксин сернистая кислота переходит в альдегид – сернистое соединение. Фуксин освобождается, окрашивая колонии в красный цвет. Микроорганизмы, не разлагающие лактозу, растут в виде бесцветных колоний. Среду Плоскирева можно отнести также и к элективным средам, для выделения палочек дизентерии, так как эта среда содержит соли желчных кислот, задерживающих рост кишечной палочки, и краситель бриллиантовый зеленый, задерживающий рост воздушной кокковой микрофлоры. Висмут–сульфит агар – это дифференциально-диагностическая среда, применяемая главным образом при диагностике сальмонеллёзов. При росте сальмонелл происходит восстановление висмута из его солей и колонии сальмонелл, в отличие от других видов микробов, окрашиваются в чёрный цвет. Применяются также комбинированные среды, содержащие не один углевод, а два или три, например, среда Олькеницкого – трёхсахарный агар с мочевиной. Среда Олькеницкого содержит лактозу (1%), сахарозу (1%), глюкозу (0,1%), мочевину, соль Мора (сульфат железа), гипосульфит натрия и индикатор. Посев микроорганизмов производится штрихом по скошенной части и уколом в столбик. При сбраживании углеводов, которые содержатся в большем количестве (лактозы, сахарозы или обоих сахаров) изменяется цвет всей среды; при сбраживании только глюкозы изменяется цвет столбика, а скошенная часть остается без изменений. Образование газа определяется по наличию пузырьков в столбике агара. Культуры, расщепляющие мочевину с образованием аммиака, дают щелочную реакцию. При этом происходит нейтрализация кислоты, образующейся при сбраживании углеводов, и цвет всей среды не изменяется. Расщепление мочевины свойственно протеям и некоторым кишечным палочкам. Другие патогенные энтеробактерии не разлагают мочевину. Добавление соли Мора и гипосульфита позволяет также изучить способность бактерий расщеплять белки с образованием сероводорода, что определяется по почернению в столбике агара в результате превращения сульфата железа в сульфид чёрного цвета. Липолитические ферменты – липазы – выявляют на ЖСА – желточно солевой агар, который содержит желток, в котором много липидов и разрушение липидов сопровождается просветлением среды Протеолитические свойства микроорганизмов, т. е. способность расщеплять белки протеолитическими ферментами, изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном. В результате расщепления молекулы белка образуются высокомолекулярные промежуточные продукты распада – пептоны, полипептиды и аминокислоты. В процессе ферментации пептонов микроорганизмами образуются: индол (С8Н7N), сероводород (H2S), аммиак (NH3) и другие соединения. Определение протеолитической активности микробова) На желатине. Мясо-пептонный желатин разливают в пробирки столбиком по 5 – 6 мл. Посев производят уколом. Посевы инкубируют в термостате, при 37°С. Вместе с опытными пробирками в термостат ставят контроль (пробирки с незасеянным желатином). При температуре 37°С желатин плавится, поэтому после инкубации пробирки, вынутые из термостата, опускают в холодную воду или ставят в холодильник. Там, где под действием фермента желатиназы произошло расщепление белков желатина, отмечается разжижение питательной среды. Наблюдение за изменением среды ведется в течение 2 сут. Характер разжижения при посеве разных микроорганизмов отличается и имеют характерную форму. б) На молочном агаре Эйкмана. Молочный агар Эйкмана, разлитый и остуженный в чашках Петри, засевают исследуемой культурой микробов. Посев делают петлей или шпателем так, чтобы получить изолированные колонии. Через 24–48 ч инкубации в термостате культуры, продуцирующие протеолитический фермент, обусловливают пептонизацию (просветление) молочного белка – казеина, в результате чего вокруг таких колоний образуются прозрачные зоны, четко выделяющиеся на общем молочно-мутном фоне среды. в) На свернутой кровяной сыворотке. Культуру исследуемых аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов засевают на поверхностно (штрихом) на чашки, анаэробных – уколом в столбик свернутой лошадиной сыворотки. Посевы инкубируют в термостате при 37°С. Штаммы, продуцирующие протеолитические ферменты, разжижая питательную среду, образуют углубления вокруг колоний или на поверхности столбика среды. Определение индола в культуре микроорганизмовПри определении видов и дифференциации разновидностей патогенных микробов наибольшее значение имеет выявление двух первых продуктов: индола и сероводорода. Для выявления индолообразования петлю исследуемой культуры засевают в среду Строгова или другие среды, рекомендуемые для обнаружения индола. Тотчас после посева в пробирку вносят полоску индикаторной бумаги, пропитанную раствором щавелевой кислоты, так, чтобы индикаторная бумага не касалась питательной среды. Для этого верхнюю треть бумажной полоски прижимают пробкой к стенке пробирки. Посевы инкубируют 24 – 48 ч, при температуре 37°С. Образование индола определяют по окрашиванию нижнего конца индикаторной бумаги в бледно-розовый цвет. Определение сероводородаСероводород является конечным продуктом расщепления аминокислот: цистина, цистеина и метионина, содержащих серу. Петлю исследуемой культуры микроорганизмов засевают в пробирку с мясо-пептонным бульоном или бульоном Хоттингера. Тотчас после посева в пробирку вносят пропитанную ацетатом свинца полоску индикаторной бумаги на определение сероводорода. В положительных случаях образующийся в культуре сероводород вступает в соединение с бесцветным ацетатом свинца и превращается в сульфат свинца, который придает индикаторной бумаге черно-бурое окрашивание. Окончательный учет результатов на образование индола и сероводорода проводят на 7–10‑й день после посева, так как процесс ферментативного расщепления белка и образования конечных продуктов распада происходит иногда в течение длительного времени. Окислительно-восстановительные свойства микроорганизмовОпределение фермента каталазыКаталаза – это фермент, катализирующий реакцию разложения перекиси водорода с образованием воды и кислорода. Каталазу содержат аэробы и факультативные анаэробы, но она отсутствует у облигатных анаэробов. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться сразу же после смешивания микробных клеток с 1% раствором перекиси водорода. На предметное стекло помещают каплю перекиси водорода и суспендируют в ней небольшое количество культуры микроорганизмов, выращенной на плотной среде. Определение уреазы. Наличие уреазы у бактерий определяют на среде с мочевиной и индикатором фенол-рот (начальный цвет среды – жёлтый). При расщеплении мочевины на аммиак и углекислый газ накапливается аммоний, что сдвигает рН в щелочную сторону и изменяет цвет индикатора на красный. Образования ацетоина (ацетил-метил-карбинола) при ферментации глюкозы проводится с помощью реакции Фогес-Проскауэра. Добавление к культуре 40% КОН и 5% альфа-нафтола даёт красное окрашивание, т.е. в щелочных условиях ацетоин образует с альфа-нафтолом соединение красного цвета – ацетилметилкарбинол. Утилизацию цитрата с целью выявления способности бактерий использовать его как источник углерода проверяют на среде Симмонса. Среда содержит набор солей, агар, неорганический источник азота, цитрат натрия, индикатор бромтимоловый синий. При наличии фермента цитрат-пермеазы среда подщелачивается и окрашивается в синий цвет. При отсутствии роста бактерий среда остается зеленой. Обнаружение цитохромоксидазы у аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов проводится путём нанесения и растирания петли культуры на индикаторную бумажку, пропитанную спиртовым раствором альфа-нафтола и 1% водным раствором ментола. При положительном результате бумажка синеет. Выявление нитратредуктазы характерно в основном для факультативных анаэробов. Фермент восстанавливает нитраты в нитриты. Нитрат является конечным акцептором электронов. В кислой среде нитраты окисляют йодид калия. Выделившийся йод, реагируя с крахмалом, даёт синее окрашивание среды. В последние годы для изучения биохимической активности выпускаются наборы систем индикаторных бумажных, микротест-системы и другие подобные системы одноразового использования, которые позволяют изучить ферментный профиль микробов. Системы индикаторные бумажные (СИБ) представляют собой наборы бумажных дисков для выявления самых разнообразных ферментов бактерий. Диски пропитаны субстратом (углеводами, аминокислотами, цитратом, ацетатом, малонатом и другими веществами), а также содержат индикатор. Полную петлю исследуемой культуры или каплю густой микробной взвеси вносят в стерильный физиологический раствор (в некоторых случаях в забуференный: рН 5,4-5,6) либо в 1% пептонную воду и помещают в эту пробирку соответствующий диск. В контрольные пробирки культуру бактерий не вносят. Для определения сероводорода диск помещают в пробирку на поверхность МПА, засеянного уколом, что позволяет одновременно определить подвижность. После инкубации в термостате оценивают результаты тестов по изменению цвета среды и диска. Утилизация вещества приводит к изменению цвета индикатора. Во всех пробирках учитывают предварительный результат в тот же день и окончательный – через восемнадцать–двадцать четыре часа. Оформление лабораторной тетради. Записать классификацию ферментов: а) по характеру вызываемых превращений: гидролазы, оксидоредуктазы, трансферазы, лиазы, изомеразы, лигазы; б) по месту локализации: эндо и экзоферменты; в) конститутивные, индуцибельные; г) по расщепляемому субстрату: сахаролитические, протеолитические, липолитические. Зарисовать приготовленные мазки из культуры выделенных микроорганизмов, по демонстрационным посевам записать биохимические свойства энтеробактерий. Ответить письменно на контрольные вопросы по теме занятия, решить тестовые задания. Контрольные вопросы по теме занятия: На чем основано разделение ферментов на конститутивные и индуцибельные? На каких средах изучают сахаролитические свойства микроорганизмов? Каков состав этих сред? На каких средах можно определить протеолитическую активность микроорганизмов? Какие свойства микроорганизмов можно изучить на желатиновых средах? Какие среды называют дифференциально-диагностическими? Как определить образование сероводорода при ферментативном расщеплении белков? На каких средах можно определить выделение индола в процессе ферментативного расщепления белков? Тесты: Способность микроорганизмов разлагать сахара и многоатомные спирты с образованием кислоты, а иногда и газа изучают на средах … а) Олькеницкого б) Гисса в) Китта-Тароцци г) Блаурокка 2. Вещества, влияющие на скорость биохимических реакций в микробной клетке, называются… а) витаминами б) ферментами в) гормонами г) ауксинами Заполните пропуск 3. В настоящее время выделяют___________ классов ферментов. а) шесть б) восемь в) пять г) десять 4. Бактерии, развивающиеся при низкой (до 1%) концентрации кислорода в окружающей среде называются… а) облигатными аэробами б) факультативными анаэробами в) аэротолерантными г) микроаэрофилами 5. К строгим анаэробам относятся… а) клостридии б) бациллы в) энтеробактерии г) микоплазмы 6. Ферменты, прочно связанные с бактериальной клеткой и действующие только внутриклеточно называются… а) экзоферментами б) эндоферментами в) апоферментами г) коферментами 7. Функция экзоферментов заключается в том, что они… а) катализируют синтез сложных органических соединений из простых б) расщепляют сложные высокомолекулярные вещества субстрата в) участвуют во внутриклеточных реакциях г) разлагают минеральные соединения |