Медицинская микробиология и вирусология ч1 (1). Т. П. Гажеева, Т. Х. Гордеева, Е. И. Хорошавина Медицинская микробиология и вирусология Часть 1
 Скачать 5.4 Mb.
|
ЗАНЯТИЕ 10. Метаболизм бактерий. Культивирование и выделение чистой культуры анаэробов.Цель занятия: Изучить механизмы дыхание бактерий, морфологию анаэробов, освоить методы культивирования анаэробов и методы выделения чистой культуры анаэробов. Материалы и оборудование: Набор красителей для окраски по Граму, предметные стекла, фильтровальная бумага, лупы, линейки, пастеровские пипетки. Демонстрационный материал: Подготовленная для стерилизации посуда (пробирки, пипетки, чашки Петри, колбы), рост анаэробов на среде Блаурокка, таблицы атлас по микробиологии. План занятия Метаболизм бактерий. Анаболизм и катаболизм. Энергетические процессы в микробной клетке. Брожение, аэробное и анаэробное дыхание. Методы культивирования анаэробов. Выделение чистой культуры анаэробов. Задание: Познакомиться с методами культивирования и выделения чистой культуры анаэробов. По демонстрационному материалу познакомиться с морфологией анаэробов. Приготовить препарат из анаэробных микроорганизмов, окрасить метиленовой синькой, посмотреть и зарисовать. Ознакомиться с основными методами дезинфекции, асептики и антисептики. Методические рекомендации к практическому занятию: Энергетический метаболизм – это совокупность биохимических реакций, результатом которых является образование (накопление энергии) и расщепление (расход энергии) макроэргических связей в молекулах АТФ. У бактерий АТФ может синтезироваться в результате процессов брожения и дыхания (аэробного и анаэробного). Брожение. Эволюционно ранний способ получения энергии, при котором в результате расщепления молекулы глюкозы в анаэробных условиях образуется 2 молекулы АТФ. Конечными продуктами брожения являются спирты, органические кислоты, СО2, вода. АТФ образуется в процессе субстратного фосфорилирования. При брожении и донором и акцептором электронов являются органические вещества. Дыханием называют процесс окислительного фосфорилирования углеводов с образованием молекул АТФ, СО2 и воды. При дыхании происходят процессы окисления и восстановления: окисление – отдача донорами (молекулами или атомами) водорода или электронов; восстановление – присоединение водорода или электронов к акцептору. Акцептором водорода или электронов может быть молекулярный кислород (такое дыхание называется аэробным) или нитраты, сульфаты, фумараты (такое дыхание называется анаэробным – нитратным, сульфатным, карбонатным, фумаратным). По типу дыхания бактерии классифицируют на четыре основные группы: 1. Облигатные (строгие) аэробы растут при свободном доступе кислорода (возбудитель туберкулеза). 2. Микроаэрофилы растут при низкой (до 1%) концентрации кислорода и повышенной концентрации углекислого газа (гемофильная палочка). 3. Факультативные анаэробы могут расти как в присутствии кислорода, так и в анаэробных условиях (кишечная палочка). 4. Облигатные (строгие) анаэробы могут расти только при полном отсутствии кислорода в окружающей среде (возбудители столбняка, ботулизма, газовой гангрены). 5. Аэротолерантные бактерии способны расти в присутствии атмосферного кислорода, но не использовать его в качестве источника энергии. Энергию аэротолерантные бактерии получают исключительно с помощью брожения (например, молочнокислые бактерии). Культивирование анаэробов Необходимым условием при культивировании анаэробов является защита их от токсического воздействия молекулярного кислорода. Это достигается при помощи физических, химических и биологических методов. Физические способы: 1. Регенерация сред. Сначала, чтобы удалить растворенный в средах кислород, среды прогревают на водяной бане в течение 15-20 минут, затем, охлаждают до 45-50°С, после посева культуры заливают стерильным вазелиновым маслом. 2. Посев в «высокий столбик агара». Питательную среду разливают в пробирки по 10 мл и прогревают на кипящей водяной бане для удаления кислорода, после чего охлаждают до температуры 45°С и вносят исследуемый материал. Инкубируют в термостате. . 3. Эвакуационно-заместительный метод заключается в механическом удалении воздуха из герметически закрытого сосуда, который называется анаэростат, при помощи вакуумного насоса с последующей заменой его инертным газом или бескислородной газовой смесью (рис.1)   Рис 1 Анаэростаты, info@mibio.ru Химические методы: 1. Применение щелочных растворов пирогаллола для поглощения кислорода в замкнутой воздушной среде 2. Применение гидросульфита натрия для поглощения кислорода из замкнутого пространства. 3. Добавление в среду редуцирующих веществ. Редуцирующие вещества используют для связывания остатков кислорода в предназначенных для роста анаэробов питательных средах. В качестве редуцирующих веществ используют: тиогликолевую кислоту, аскорбиновую кислоту, различные сахара, цистин и цистеин. Для адсорбции кислорода к питательным средам до их стерилизации добавляют кусочки печени, селезенки, ткани мозга, яичного белка. Среда Китт-Тароцци – жидкая среда (МПБ), содержит кусочки печени и 0.5% глюкозы. Перед посевом среду кипятят на водяной бане 15-20 минут, сверху заливают слоем вазелиного масла, чтобы предохранить посев от проникновения кислорода. Среда Вильсон – Блера, состав: глюкоза, сернисто-кислый натрий, хлорид железа. На этой среде анаэробы образуют черные колонии за счет восстановления сернисто-кислого натрия в сернистый натрий, который, соединяясь с хлоридом железа, образуют осадок черного цвета – сернистое железо. 4. Применение газогенерирующих систем для создания анаэробных условий используют в микроанаэростаты, эксикаторы. Для образования водорода и двуокиси углерода используют специальные таблетки, которые активируются добавлением воды. Водород генерируется таблетками боргидрида натрия. Углекислый газ вырабатывается при взаимодействии лимонной кислоты с бикарбонатом натрия. 5. Биологический метод. Метод Фортнера основан на совместном выращивании аэробов и анаэробов. В чашку Петри наливают МПА с 1- 2% глюкозой. Посередине чашки стерильным скальпелем вырезают канавку шириной 1-1,5 см, которая делит питательную среду на две половины. На одну половину засевают культуру аэроба или факультативного анаэроба, на другую – облигатно анаэробные бактерии, свободное пространство между дном и ее крышкой заклеивают лейкопластырем (можно залить парафином или запечатать пластилином). Посевы ставят в термостат. В процессе культивирования сначала вырастут аэробы, а затем после того как они поглотят кислород, находящийся в чашке, начнут расти анаэробы.  Рис.2 Культивирование анаэробов методом Фортнера Методы выделения чистой культуры анаэробов 1. Метод Цейсселера. Исследуемый материал засевают бактериологической петлей штрихами или шпателем по поверхности плотной питательной среды, помещают в анаэробные условия и культивируют в термостате при 37°С в течение 24-72 ч. Изолированные колонии анаэробов пересевают в среду для контроля стерильности или среду Китта-Тароцци. 2. Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материала вносят в пробирку с 4-5 мл раствора хлористого натрия, перемешивают и переносят в пробирку с охлажденным до 45-50°С сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания последовательно засевают еще в две пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают под струей холодной воды. Выросшие через 24-72 ч в глубине агара изолированные колонии анаэробов выделяют и затем засевают в среду Китта-Тароцци. 3. Метод Виньяля-Вейона. В пробирку с 0,5% расплавленным и охлажденным до температуры 40-45°С сахарным агаром вносят пипеткой небольшое количество исследуемого материала и тщательно размешивают. Затем содержимым пробирки заполняют капилляры трех пастеровских пипеток. После заполнения вытянутый конец трубки запаивают и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2-3 суток в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов. Питательные среды для выделения анаэробных микробов: анаэробный кровяной агар с гентамицином, анаэробный кровяной агар с неомицином, анаэробный кровяной агар с канамицином и ванкомицином, фруктозо-циклосерин-цефокситиновая среда, тиогликолевая полужидкая среда, среда Китта-Тароцци (жидкая среда с кусочками мяса и вазелиновым маслом на поверхности), среда Вильсона-Блера (железо-сульфитный агар). Облигатные анаэробы растут в глубине столбика этой среды, давая колонии чёрного цвета за счёт восстановления сернокислого натрия в сульфат натрия, который, соединяясь с хлорным железом, образует чёрный осадок сернистого железа. Требования, предъявляемые к питательным средам для выращивания облигатных анаэробов: a) соответствовать сложным пищевым потребностям анаэробов и обеспечивать их быстрый рост, в связи с этим для культивирования анаэробов используют высокопитательные среды, содержащие пептоны (1,5 – 2%), дрожжевой экстракт (0,5%), витамин К, гемин; б) содержать стимулирующие рост микробов добавки˸ бараньи эритроциты (5%), лошадиную сыворотку (5-10%), твин-80 (0,02%); пируват натрия (0,9%); глюкозу (0,5%); L – аргинин (0,1%); в) иметь низкий окислительно-восстановительный потенциал, что достигается путем добавления редуцирующих веществ. Редуцирующий агент, связывая свободный кислород, снижает окислительно-восстановительный потенциал среды. В качестве нетоксичных редуцирующих агентов, обеспечивающих восстановительные условия среды, используют цистеина гидрохлорид (0,025%), тиогликолят натрия (0,05%). В некоторые среды (Китта-Тароцци) добавляют кусочки тканей паренхиматозных органов (легкие, печень); г) содержать селективные добавки, что обеспечивает избирательное выделение облигатно анаэробных микроорганизмов. В качестве селективных добавок используют антибиотики аминогликозидного ряда, к которым анаэробы природно устойчивы. Оформление лабораторной тетради: Зарисовать приготовленные и окрашенные препараты анаэробов. Переписать схемы выделения чистых культур анаэробов. Заполните таблицу «Культивирование анаэробов».
Контрольные вопросы по теме занятия: 1. Перечислите пути получения энергии микроорганизмами. 2. Каковы различия между аэробным и анаэробным типом дыхания 3. Опишите энергетические процессы при брожении.. 4. Какие реакции лежат в основе гомо- и гетероферментативного молочнокислого брожения? 5. Назовите бактерии маслянокислого брожения. 6. Перечислите патогенные анаэробы. Тесты: 1.Все реакции жизнеобеспечения, происходящие в бактериальной клетке, составляют … а) гомеостаз б) метаболизм в) катаболизм г) анаболизм 2. Биологический процесс, происходящий в клетках прокариот, при котором вместо кислорода в качестве конечного акцептора электронов используется ряд окисленных органических или неорганических соединений, называется … а) брожением б) анаэробным дыханием в) аэробным дыханием г) окислением 3. Совокупность процессов синтеза органических веществ в клетке, идущий с потреблением энергии АТФ, называется … а) катаболизмом б) анаболизмом в) метаболизмом г) гомеостазом 4. Процесс полного окисления органического или неорганического субстрата, идущий при наличии внешнего окислителя и дающий энергию в виде АТФ, называется … а) брожением б) дыханием в) гидролизом г) анабиозом 5. Микроорганизмы, использующие в качестве источника углерода органические соединения, являются … а) автотрофами б) гетеротрофами в) литотрофами г) прототрофами 6. К условиям, необходимым для выделения чистой культуры анаэробов, относят … а) пропускание через питательную среду струю воздуха б) выращивание на специальных средах и в анаэростате в) выращивание на простых питательных средах в термостате г) выращивание исключительно на жидких питательных средах | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||