Медицинская микробиология и вирусология ч1 (1). Т. П. Гажеева, Т. Х. Гордеева, Е. И. Хорошавина Медицинская микробиология и вирусология Часть 1
 Скачать 5.4 Mb.
|
ЗАНЯТИЕ 2. Структура бактериальной клетки и методы ее изучения. Окраска по ГрамуЦель занятия: Ознакомиться с назначением сложных методов окраски. Научиться окрашивать препараты по методу Грама. Ознакомиться с методом окраски кислотоустойчивых бактерий (метод Циля-Нильсона) Изучить строение клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий. Материалы и оборудование: Микроскоп. Набор готовых растворов красок во флаконах: генциан-фиолетовый, фуксин Пффейфера, раствор Люголя, спирт. Бактериологические петли и иглы. Предметные стекла, покровные стекла, стеклянный мостик в ванночке для окраски препаратов, промывалка с водой. Дезинфицирующая жидкость, вата, марлевая салфетка, карандаш по стеклу, иммерсионное масло, фильтровальная бумага, спички. Чистые культуры микроорганизмов, выращенные на агаровой среде. План занятия Механизм и принцип окраски по Граму. Значение для идентификации бактерий по тинкториальным признакам. Особенности строения клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий. Отличительные признаки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Протопласты, сферопласты и L-формы бактерий. Окраска кислотоустойчивых бактерий. Метод Циля-Нильсена. Задание: 1. Освоить метод Грама, для чего приготовить препараты из культур микроорганизмов: Micrococcus lisodecticus, Escherichia coli, Bacillus antracoides. Окрасить по Граму. Промикроскопировать и зарисовать. 2. Посмотреть и зарисовать демонстрационные мазки туберкулезной палочки, окрашенной по Цилю-Нильсену. Найти в препарате рубиново-красные микобактерии, некислотоустойчивые бактерии синего цвета. 3. Изучить строение прокариотической клетки по таблице и электронным фотографиям. 4. Зарисовать схему строения клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий Методические указания к практическому занятию: Сложные методы окраски имеют дифференциально-диагностическое значение для характеристики изучаемого микроба. К сложным методам окраски относятся: окраска по методу Грама, окраска кислотоустойчивых бактерий по Цилю-Нильсену, окраска спор, жгутиков, капсулы и т.д. Окраска бактерий по Граму. Окраска предложена в 1884 г. датским исследователем Х. Грамом. В настоящее время способ окраски по Граму является необходимым диагностическим методом в микробиологической практике. Все бактерии в зависимости от способности окрашиваться по Граму разделяются на две группы – грамположительные и грамотрицательные формы. Принцип окраски состоит в том, что при обработке мазков микроорганизмов генцианвиолетом, а затем раствором Люголя, содержащим йод, препараты окрашиваются в черный цвет ((образуется комплекс генцианвиолет-йод). После обработке спиртом некоторые препараты сохраняют сине-фиолетовую окраску (грамположительные бактерии). Другие бактерии не способны удерживать краску и при обработке спиртом обесцвечиваются (грамотрицательные). Различие в окраске объясняется особенностями химического строения бактерий и ультраструктурой клеточных стенок, которые постоянны для определенного вида. Клеточная стенка грамположительных бактерий содержит многослойный муреин (составляет 40–90% сухого вещества) и тейхоевые кислоты. Белки грамположительных бактерий имеют более кислый характер и лучше окрашиваются основными красителями, чем у грамотрицательных бактерий. Кроме того, грамположительные бактерии содержат рибонуклеат магния, который взаимодействует с образующимся в процессе окраски комплексом и препятствует вымыванию его спиртом. В состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий входят липопротеиды, липополисахариды, фосфолипиды и небольшое количество муреина (5–10% сухого вещества). На результат окрашивания оказывают влияние небольшие отклонения в условиях культивирования или в методе окраски, возраст культуры, кислотность среды (в кислой среде, как правило, все бактерии грамотрицательны). Техника окраски по Граму 1. На фиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги и наносят несколько капель раствора карболового или же анилинового раствора генцианвиолета на 1–2 минуты. 2. Снимают пинцетом бумагу. Не промывая препарат водой, сливают краску и наносят раствор Люголя на 1 мин. до полного почернения. 3. Сливают раствор Люголя, не промывая водой погружают препарат в стаканчик с 96о спиртом на 20-30 сек. Обесцвечивание проводят до полного отхождения фиолетовых струй краски. 4. Препарат тщательно промывают водой для удаления спирта. 5. Докрашивают препарат фуксином Пфейффера (разведенный 1:10 фуксин Циля) в течение 3 минут. 6. Промывают препарат водой. 7. Высушивают и микроскопируют при помощи иммерсионной системы. Микроскопическая картина: при правильной окраске мазков по Граму: микроорганизмы грамположительные будут окрашены в темнофиолетовый цвет, а грамотрицательные – в цвет дополнительной краски ( фуксином 1:10 в розовый цвет). Рекомендации. Для определения отношения микроорганизмов к окраске по Граму следует использовать молодые, лучше суточные культуры, так как микроорганизмы из старой культуры неодинаково интенсивно окрашиваются по Граму. Мазки, нанесенные на стекло, должны быть по возможности тонкими и ровными. При толстом мазке дифференциация его будет затруднена. Окраска в модификации Синева. Модификацией окраски по Граму является способ Синева, при котором вместо жидкой краски генцианового фиолетового используют полоски фильтровальной бумаги, заранее пропитанные этой краской и высушенные. Техника окраски. На фиксированный мазок наливают 2–3 капли дистиллированной воды, опускают и придавливают к стеклу пинцетом полоску бумажки приготовленной вышеуказанным способом. Бумажку через 2 минуты снимают пинцетом. Дальше продолжается обычная обработка раствором Люголя, спиртом или йодированным спиртом, водой и дополнительная окраска. Экспресс-метод Грезерсона. Клетки культур (лучше 1-2-суточные) помещают петлей в каплю 3%-го раствора КОН на предметное стекло, размешивают круговыми движениями и через 5-8 с петлю резко поднимают. Суспензия грамотрицательных бактерий становится вязкой и тянется за петлей, образуя тяжи. Грамположительные бактерии равномерно распределяются в капле щелочи (как в воде). Реакцию считают отрицательной, если образование слизистых тяжей не наблюдается в течение 60 с. Увеличение вязкости вызвано лизисом клеточных стенок грамотрицательных бактерий в растворе щелочи и освобождением ДНК.  Окраска кислотоустойчивых микроорганизмов. Кислотоустойчивыми называют бактерии, которые с трудом воспринимают красящие вещества, в силу чего на них приходится действовать сильными, концентрированными растворами красок с подогревом. При последующем же воздействии кислот они не обесцвечиваются и таким образом могут быть дифференцированы от других микроорганизмов, не обладающих этим свойством. Кислотоустойчивость бактериальной клетки связана с особым химическим составом клеточной стенки (наличие липидов и миколовых кислот). Из патогенных бактерий кислотоустойчивостью обладают микобактерии туберкулеза и лепры. В основе окраски кислотоустойчивых бактерий лежит принцип применения факторов, усиливающих реактивность веществ, находящихся в бактериальной клетке. К таким воздействиям относятся: увеличение концентрации краски, высокая температура. Для увеличения степени проницаемости бактериальной клетки препарат окрашивают фуксином Циля при подогревании. Окрашенные микроорганизмы не обесцвечиваются слабыми растворами неорганических кислот и спиртами. Техника окраски по Циль-Нильсену Фиксированный на пламени мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги, наливают на нее карболовый раствор фуксина и подогревают; при появлении паров прекращают нагревание и оставляют краску на препарате еще на несколько минут (2–3 минуты). Дают препарату остыть, удаляют пинцетом бумажку и обмывают мазок водой. Обесцвечивают препарат 5–10% водным раствором серной кислоты в течение 3–5 секунд (до желтоватого оттенка мазка). Вместо серной кислоты можно применить 5% раствор азотной или 3% раствор соляной кислоты. Мазок тщательно промывают водой. Споласкивают 96°спиртом. Снова промывают водой. Докрашивают в течение 3–5 минут метиленовой синькой или водным раствором 1:10 малахитовой зелени или метиловой зелени. Краску смывают водой и препарат высушивают. Микроскопическая картина: микобактерии туберкулеза – рубиново-красные, остальные некислотоустойчивые – синие.  Рис. Micobacterium tuberculosis. Мазок мокроты больного туберкулезом. Окраска по Цилю-Нильсену. Карпова М.Р., Жданова О.С., 2010 Оформление лабораторной тетради: Зарисовать приготовленные и окрашенные препараты (окраска по методу Грама), а также схематическое строение клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий, зарисовать демонстрационные микропрепараты туберкулезной палочки, окрашенной по Цилю-Нильсену. Нарисуйте внутреннюю структуру бактериальной клетки и сделайте соответствующие обозначение цифрами: Клеточная стенка Цитоплазматическая мембрана Нуклеоид Цитоплазма Рибосомы Мезосомы Включения запасных веществ. Домашнее задание: Ответить письменно на контрольные вопросы по теме, решить тесты. Контрольные вопросы по теме: 1. Какие методы окраски микроорганизмов называют сложными? Для чего они используются? 2. В чем принцип и механизм метода окрашивания бактерий по методу Грама? 3. Почему бактерии окрашиваются по-разному методом Грама? 4. Какие факторы оказывают влияние на результат окрашивания по Граму? 5. Какова последовательность действий при окрашивании бактерий методом Грама? 6. На чем основан экспресс- метод Грезельсона? 7. В чем отличия с строении грамположительных и грамотрицательных бактерий? 8. Приведите примеры грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Тестовые задания: 1. Способность фиксированных клеток эубактерий сохранять окраску кристаллическим фиолетовым красителем после обработки спиртом, связана со строением… а) клеточной стенки б) цитоплазматической мембраны в) мезосомы г) аэросомы 2. К грамположительным бактериям относятся… а) спирохеты б) энтеробактерии в) кокки г) спириллы 3. Шаровидными бактериями, которые не окрашиваются по методу Грама, являются… а) гонококками б) сарцинами в) микрококками г) стафилококками 4. Особенностью строения грамотрицательных бактерий является… а) наличие наружной мембраны б) наличие цитоплазматической мембраны в) отсутствие муреина в клеточной стенке г) отсутствие жгутиков 5. Прокариоты, споры которых являются покоющимися клетками и одновременно репродуктивными структурами, называются… а) актиномицеты б) цианобактерии в) риккетсии г) цитофаги 6. Грамотрицательные и грамположительные бактерии различаются строением… а) жгутиков б) клеточной стенки в) рибосом г) цитоплазматической мембраны 7. К грамположительным бактериям относятся… а) актиномицеты б) спирохеты в) хламидии г) энтеробактерии 8. Клеточная стенка состоит только из белка у… а) галофильных бактерий б) миксобактерий в) стрептококков г) микобактерий 9. Липополисахаридный комплекс в составе клеточной стенки имеют… а) стафилококки б) клостридии в) энтеробактерии г) архебактерии 10. L-формы представляют собой бактерии, у которых отсутствует… а) жесткая клеточная стенка б) цитоплазматическая мембрана в) нуклеоид г) рибосомы 11. Клеточные структуры бактерий, синтезирующие АТФ, называются… а) тилакоидами б) плазмидами в) транспозонами г) мезосомами 12. К структурным компонентам прокариот относят… а) хлоропласты б) мезосомы в) аппарат Гольджи г) клеточный центр |