Медицинская микробиология и вирусология ч1 (1). Т. П. Гажеева, Т. Х. Гордеева, Е. И. Хорошавина Медицинская микробиология и вирусология Часть 1
 Скачать 5.4 Mb.
|
ЗАНЯТИЕ 3. Ультраструктура бактериальной клетки.Цель занятия: Изучить особенности ультраструктуры прокариотической клетки. Ознакомиться со специальными методами окраски спор, капсул, жгутиков. Материалы и оборудование: Микроскоп. Набор готовых растворов красок во флаконах, фуксин Пффейфера, фуксин Циля, спирт, метиленовая синька. Бактериологические петли и иглы. Предметные стекла, покровные стекла, стеклянный мостик в ванночке для окраски препаратов, промывалка с водой. Дезинфицирующая жидкость, вата, фланелевая салфетка, карандаш по стеклу, иммерсионное масло, фильтровальная бумага, спички. Чистые культуры микроорганизмов, выращенные на агаровой среде План занятия Ультраструктура прокариотической клетки. Основные структурно-функциональные отличия прокариотов и эукариотов. Капсула. Химический состав. Методы выявления. Жгутики. Строение. Расположение на клетке. Методы выявления. Клеточная стенка, строение и методы выявления Споры и другие покоящиеся клетки. Включения как запасные вещества. Методы выявления. Задание: Приготовить препарат из культуры антракоидной палочки, покрасить по Бурри – Гинсу, промикроскопировать и зарисовать. Приготовить препарат из культуры антракоидной палочки, окрасить по Златогорову, промикроскопировать и зарисовать. Приготовить препарат из культуры кишечной палочки, окрасить одним из дифференцирующих методов. Приготовить препарат «висячая капля» из культуры кишечной палочки. Промикроскопировать. Методические рекомендации к практическому занятию Различия в строении клеток прокариот и эукариот
Поверхностные структуры бактериальной клетки – капсула, жгутики, пили. Капсула плотный слизистый слой окружает клеточную стенку снаружи. Слизистое вещество капсулы содержит полисахариды, у некоторых микроорганизмов в состав капсулы входят азотсодержащие соединения (глюкозамин, глюкуроновую кислота). Слизистое вещество капсул следует рассматривать как продукт жизнедеятельности поверхностных слоев цитоплазмы, выделяемой клеточной оболочкой наружу. В зависимости от толщины слизистого слоя выделяют микрокапсулу (меньше 0,2 мкм, обнаруживается только при электронной микроскопии) и макрокапсулу (больше 0,2 мкм, обнаруживается в световом микроскопе). Функция капсул – защитная, от неблагоприятных условий среды, а у патогенных микроорганизмов ( фактор патогенности), защита от фагоцитоза и антител. Методики окрасок капсул Метод окраски капсул по Бурри – Гинсу. На предметное стекло наносят пипеткой каплю исследуемой культуры и каплю черной туши, разведенной в 10 раз. Каплю равномерно распределяют по стеклу (мазок готовится по типу мазка крови). Высушивают на воздухе. Затем наливают2-3 капли спирта и сжигают его на стекле. Этим достигается фиксация мазка. Докрашивают препарат фуксином Пфейффера 3–5 минут. Промывают водой и высушивают. Изучают под микроскопом с помощью иммерсионной системы. Бактерии окрашиваются в красный цвет, капсула не окрашенная, контрастно выделяется на темном фоне препарата. Способ окраски капсул по Михину.Фиксированный мазок окрашивают метиленовой синькой в течение 2–3 минут при подогревании (до появления паров). Затем краску быстро смывают водой и мазок высушивают фильтровальной бумагой. Лучше окрашивать старым раствором краски. Микроскопичиская картина: капсулы – светло-розовые, бактерии –темно-синие. С успехом можно окрашивать капсулы краской Романовского-Гимза. На фиксированный мазок наносят раствор краски (2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды) на 15–20 минут. Краску быстро смывают водой и мазок обсушивают фильтровальной бумагой. Микроскопическая картина: капсулы – бледно-розового цвета, бактерии – синие. Жгутики – обеспечивают подвижность бактерий. Присутствуют у многих бактерий и являются видовым признаком. По расположению и числу жгутиков на поверхности клетки бактерии подразделяются: • монотрихи – имеют один жгутик (например, бактерии родов Caulobacterи Vibrio); лофотрихи – имеют на одном или на обоих полюсах клетки пучок жгутиков (например, бактерии родов Pseudomonas, Chromatium); амфитрихи – имеют по жгутику на обоих полюсах клетки (например, бактерии рода Spirillum); перитрихи – большое количество жгутиков, располагающихся по всей поверхности клетки (например, бактерии вида E.coliи рода Erwinia)  Рис. Жгутикование бактерий: A — монотрихиальное, B — лофотрихиальное, C — амфитрихиальное, D — перитрихиальное Обычная толщина жгутика – 10–20 нм, длина – от 3 до 15 мкм. В химическом отношении жгутики представляют собой белок флагеллин. Свое начало жгутики берут от базального тела встроенного в клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану.  Рис. Модель жгутика грамотрицательных бактерий. (по T. Паустиану, 2001) Базальное тело у грамотрицательных бактерий состоит из двух пар колец, а у грамположительных – из одной пары колец. Вращение жгутика определяется вращением колец (главным образом М-кольца, встроенного в цитоплазматическую мембрану). Характер движения бактериальной клетки определяется числом и расположением жгутиков. Монотрихи движутся прямолинейно, перитрихи – беспорядочно кувыркаясь. Движение жгутиков прокариот обеспечивается энергией трансмембранного электрохимического потенциала. Выявление жгутиков. Наблюдать за движением бактерий можно в прижизненных препаратах – «раздавленная» и «висячая» капли. На прижизненных препаратах отмечают быстроту и характер движения бактериальных клеток. Методика приготовления препарата «висячая» капля. На середину необезжиренного покровного стекла наносят маленькую каплю суспензию микроорганизмов. Каплю материала покрывают предметным стеклом с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином. Предметное стекло, с прилипшим к нему покровным стеклом, переворачивают Капля оказывается висячей в герметически закрытой во влажной камере. Висячую каплю микроскопируют и рассматривают под иммерсией.  предметное стекло с лункой покровное стекло капля микробной взвеси В световом микроскопе жгутики бактерий можно наблюдать лишь после специальных методов обработки и окраски мазков. На окрашенных мазках можно видеть расположение жгутиков, их число и длину. Окраска жгутиков требует внимание и аккуратности, так как при фиксации жгутики легко повреждаются и теряются клеткой. Несмотря на много способов, предложенных в разное время, простым и надежным является метод Леффлера. Метод Леффлера Берут 18-часовую агаровую культуру микроорганизма, выращенную при оптимальных условиях. Захватывают петлей или пастеровской пипеткой немного культуры из нижней части посева. В пробирку наливают 5-6 мл водопроводной воды (физ.раствор использовать нельзя). В эту воду осторожно погружают петлю или пипетку с культурой и оставляют до тех пор, пока бактериальная масса не разойдется равномерно в жидкости. Берут каплю суспензии и проверяют под микроскопом подвижность бактерий. Если культура подвижная, ее можно использовать для окраски. Сначала готовят препарат, для этого пастеровской пипеткой набирают немного суспензии и мелкими каплями наносят на предметной стекло, высушивают, осторожно фиксируют на пламени горелки и обрабатывают при подогревании в течение 0,5-1 минуты специальной протравой. Состав протравы: 20% водный раствор танина – 100 мл, насыщенный водный раствор сернокислого закисного аммиачного железа 50 мл, насыщенный спиртовой раствор основного фуксина 10 мл. Препарат тщательно промывают слабой струей воды и слегка высушивают на воздухе, затем окрашивают карболовым раствором фуксина при подогревании в течение 2-3 минут, промывают водой и высушивают, микроскопируют. Споры. В условиях, неблагоприятных для вегетативных клеток бактерии образуют споры. Наиболее часто бактерии образуют эндоспоры. Бактерии, способные к образованию эндоспор называют бациллами и клостридиями. Спорообразование – генетически детерминированный процесс. Образование эндоспор часто сопровождается недостатком в среде питательных веществ, накоплением продуктов метаболизма. Эндоспоры различных видов бактерий отличаются по размеру, форме, локализации в материнской клетке. В зависимости от этих признаков различают следующие типы спорообразования: Бациллярный тип. Споры овальные или цилиндрические, не толще материнской клетки. Расположены центрально, эксцентрально или терминально. Клетка имеет форму палочки. Таковы споры большинства бацилл.  Рис. Форма эндоспор и расположение их в клетках бактерий различных видов рода Bacillus(по Х. Вилсону, 2007) Клостридиальный тип. Овальные споры шире материнской клетки; они «раздувают» клетку изнутри в ходе споруляции, клетка имеет форму веретена. Плектридиальный тип. Почти круглая спора в набухшем конце материнской клетки. Споры шире материнской клетки, поэтому она приобретает форму барабанной палочки. Клостридиальный и плектридиальный типы присущи в основном бактериям рода Clostridium и могут одновременно встречаться в культуре одного вида. Споры имеют очень плотную оболочку, состоящую из наружного и внутреннего слоев. Все специальные методы окраски спор основаны на действии различных протрав, изменяющих структуру оболочки и тем облегчающих проникновение в споры красящего вещества. После протравливания препараты окрашивают обычно карболовыми растворами красок с подогреванием мазка, последующим обесцвечиванием и дополнительной окраской. Эндоспоры очень устойчивы к простому окрашиванию, но, будучи однажды окрашенными, они довольно устойчивы и к обесцвечиванию. Выявление спор. Ввиду слабой проницаемости многослойных оболочек споры бактерий при обычной окраске мазка не прокрашиваются и под микроскопом имеют вид бесцветных ярко светящихся теней споры. Все специальные методы окраски спор основаны на действии различных протрав, изменяющих структуру оболочки и тем облегчающих проникновение в споры красящего вещества. После протравливания препараты окрашивают обычно карболовыми растворами красок с подогреванием мазка. Окрасившийся протопласт споры, обладает высокой кислотоустойчивостью по сравнению с протопластом вегетативной клетки. Он не обесцвечивается при дифференциации мазка в кислоте и сохраняет воспринятую им окраску. Вегетативные клетки бактерий, напротив, полностью отмывается в кислоте и на препарате имеют цвет дополнительного красителя (метиленовой синькой). Метод окрашивания спор по Златогорову. Мазок фиксируют над пламенем спиртовки. На его поверхность кладут фильтровальную бумагу величиной с покровное стекло, окрашенную фуксином Циля. Бумажку смачивают 3-5 каплями воды. Окрашивание проводят при подогревании в течении 4-5 минут. Чтобы мазок не высыхал, во время испарения жидкости добавляют воду или краску (осторожно по каплям, чтобы не треснуло горячее стекло). Бумажку убирают. Затем мазок обесцвечивают 3% раствором серной кислоты, (в течение 5-10 сек.) и промывают водой. Дополнительное окрашивание метиленовой синью проводят в течении 3-5 минут. После этого мазок промывают и высушивают. В поле зрения микроскопа видно, что споры окрашены в красный цвет, а вегетативные клетки – в синий. Метод Ожешко 1. Приготовить тонкий мазок, высушить на воздухе. Не фиксировать! 2. Обработать мазок 0,5 %-м раствором соляной кислоты, которую наливают в избытке и подогревают в течение 2 минут на спиртовке. Стекло держат высоко над пламенем до появления паров. 3. Остудить стекло и слить кислоту. Промыть препарат водой. 4. Окрасить мазок карболовым фуксином Циля, подогревая на небольшом пламени до появления паров, в течение 5 минут. Затем остудить и промыть водой. 5. Обработать мазок 1 %-м раствором серной кислоты в течение 2 минут. Быстро промыть водой. После такой процедуры клетки бактерий обесцвечиваются. 6. Провести дополнительную окраску спиртовым раствором метиленового синего в течение 5 минут, после чего обильно промыть водой и просушить. Микроскопическая картина: споры окрашиваются в красно-розовый цвет, а вегетативные клетки бактерий – в сине-голубой. 7. Сделать зарисовки. Цитоплазматические включения У многих бактерий, выращиваемых в определенных условиях, в результате обменных процессов в цитоплазме образуются отложения, которые называют включениями. Среди них отложения жира, поли-β-оксимасляной кислоты, полифосфата, крахмалоподобных полисахаридов, серы и различных кристаллов. Некоторые из них представляют собой полимеризованные ненужные продукты, а другие можно отнести к запасам питательных веществ. Для выявления этих включений, которые к тому же преломляют свет, применяется несколько методик окраски. Окрашивание поли- β -оксимасляной кислоты Для выявления цитоплазматических включений в бактериях используют следующий метод: Фиксированный нагреванием мазок на предметном стекле погружают в раствор 0,3%-ного (вес/объем) судана черного В, приготовленного на этиленгликоле. Фильтруют и окрашивают в течение 5 - 15 мин. (время определяют экспериментально). Краситель сливают, и препарат высушивают на воздухе, положив предметное стекло на промокательную бумагу. Несколько раз погружают и промывают предметное стекло в ксилоле, а затем подсушивают впитывающим ксилол материалом. Дополнительно окрашивают препарат в течение 15 - 10 с 0,5%-ным (вес/объем) водным сафранином. Промывают предметное стекло водопроводной водой, подсушивают и смотрят в микроскоп. Включения поли-β-оксимасляной кислоты выглядят как черно-синие капельки, в то время как цитоплазма окрашивается в розовый цвет. Окрашивание полифосфата Включения, состоящие из неразветвленных структур с элементным составом Мn+2РnО3n+1, выявляют следующим образом. Мазок на предметном стекле фиксируют нагреванием. Окрашивают его в течение 10–30 сек., в растворе метиленового синего по Леффлеру или в 1%-ном толуидиновом синем. Отмывают краситель водопроводной водой, подсушивают и смотрят в микроскоп. При окраске метиленовым синим гранулы полифосфата выглядят шариками, имеющими цвет от синего до фиолетового, а вся остальная цитоплазма окрашивается в светло-голубой цвет. Толуидиновый синий окрашивает метахроматически, и гранулы имеют красный цвет на фоне голубой цитоплазмы. Оформление лабораторной тетради: Микроскопировать и зарисовать приготовленные и окрашенные препараты, внесите в таблицу основные методы окраски бактериальной клетки (по Граму, Цилю-Нильсену, Бурри-Гинсу, Златогорову), заполнить таблицу 1 Таблица1 Основные методы окраски бактериальной клетки
Домашнее задание: Ответить на контрольные вопросы и тестовые задания. Контрольные вопросы по теме занятия Отличительные признаки строения эукариотической и прокариотической клеток. Перечислите обязательные для всех бактерий структурные компоненты. Укажите значение клеточной стенки. Охарактеризуйте возможные варианты строения клеточной стенки. 5.Перечислите основные методы окрашивания для выявления различных структур бактериальной клетки. 6. Капсула бактерий. Химический состав, значение, методы выявления. 7. Эндоспора. Строение. Спорообразование, выявление спор. Тесты: 1.Тинкториальные свойства бактерий характеризуют … а) чувствительность к антибиотикам б) устойчивость к физическим факторам среды в) устойчивость к бактериофагам г) отношение к определенному методу окраски. 2. Устойчивость неспорообразующих бактерий к кислотам, щелочам и спиртам обусловлена высоким содержанием в клеточной стенке … а) восков и липидов б) муреина и фосфолипидов в) тейхоевых кислот и глицерина г) нуклеиновых кислот и полифосфатов 3. Клеточные структуры бактерий, выполняющие функцию митохондрий, называются … а) плазмидами б) тилакоидами в) мезосомами г) транспозонами 4. Основу бактериального жгутика составляет белок … а) флагеллин б) тубуллин в) миозин г) липид А 5. В состав кортекса спор бактерий входит… а) белок б) липопротеин в) пептидогликан г) липид 6. В составе капсулы бактериальной клетки отсутствуют… а) полисахариды б) полипептиды в) нуклеиновые кислоты г) декстраны 7. К структурным компонентам, обнаруживаемым только в прокариотической клетке, относится… а) плазмида б) митохондрия в) лизосома г) пероксисома 8. Обратимой стадией спорообразования является… а) образование оболочек споры б) образование кортекса в) прорастание споры г) формирование проспоры 9. Бактерии, образующие споры, называются… а) стрептококками б) бациллами в) сарцинами г) энтеробактериями 10. Бактерии, имеющие один пучок жгутиков на полярном конце, называются… а) лофотрихами б) монотрихами в) амфитрихами г) перитрихами 11. Для обнаружения спор в чистой культуре бактерий используют окраску по методу … а) Златогорова б) Грама в) Бурри г) Циля-Нильсона |