portal.guldu.uz-БИОКИМЁ (1). Учебнометодический комплекс по "Биохимия" подгатовленной на основе современной педтехнологии. Настоя щ ий комплекс подготовлен
 Скачать 4.32 Mb.
|
|
Муҳокама учун саволлар: 1.1 Лизин, валин, аланин, цистеин, триктофан аминокислоталари тузилиши ёзиб, фаркларини курсатинг? 1.2 Глицил-валил-аргинил-лейцил-аспарин кетма-кетликдаги пептид богларни ёзинг? Фойдаланилган дарслик ва ўқув қўлланмалар рўйхати: Асосий: 1.Тўрақулов Ё.Х. Биохимия. Тошкент. «Ўзбекистон», 1996. 2.Ленинжер А. Основы биохимии. 3-жилдли, М., Мир, 1984. 3.Филипович Ю. Основы биохимии. М., Высшая школа, 1985. 4.Қосимов А. ва бошқалар. Биохимия. Тошкент. Ўқитувчи, 1987. Қўшимча 1. Николаев А.Н., Султанов Р.Г. «Биохимиядан амалий машғулот». Т. 1989. 2. Алейникова Т.Л. «Руководство к практическим занятиям по биохимии». М. 1987. 3. Шапиро Д.К. «Практикум по биологической химии», М., Высшая школа. 1976. 4 . www. Referat. Ru; 3- савол бўйича дарс мақсади: Оқсилларни ўрганиш усуллари, хоссалари, оддий ва мураккаб оқсиллар ҳақида маълумот бериш. Идентив ўқув мақсадлари. 1.1 Оқсилларни ўрганиш усулларини тушинтириб бера олади. 1.2 Оқсилларнинг хоссаларини айтиб бера олади. 1.3 Оддий ва мураккаб оқсилларни изоҳлаб беради. Учинчи савол баёни: Оқсилларни ажратиб олиш. Оқсилларнинг кимёвий хоссаларини ўрганиш учун, аввало, уларни соф ҳолда ажратиб олиш керак. Оқсилларни соф ҳолда ажратиб олиш анча қийин. Чунки улар кўпгина кимёвий реактивлар (кучли кислота, кучли ишқор, органиқ эритувчилар) таъсирида осонлик билан парчаланади. Бундан ташқари, ажратиб олиш процессида улар автолезга учраши(ўз-ўзидан парчаланиш) ҳам мумкин. Натижада оқсил ўзининг натив, бошқача айтганда, табиий хусусиятларини(эритувчанлиги, биологик фаоллиги ва бошқаларни) йўқотади. Оқсилларни денатурацияга учрамасдан ажратиб олиш учун эҳтиётлик билан ишлаш зарур. Бунинг учун, энг аввал, оқсилларни ажратиб олишнинг барча босқичлари иложи борича паст (0-5) ҳарората ўтиши керак. Кўп ҳолларда қўлланиладиган эритувчининг музлаш даражаси энг яхши ҳарорат ҳисобланади. Оқсилларни ажратишаги зарурий шартлардан бири рН маълум даражада бўлишидир. Муҳит рН кўпинча нейтрал ёки ажратиб олинаётган оқсилнинг изоэлектрик нуқтасига яқин бўлиши керак. Шунинг учун натив ҳолаги оқсилни ажратиб олишда кислота ва ишқорлардан фойаланилмайди. Оқсиллар икки йўл билан ажратиб олинади. Эритувчи оқсиллар (масалан, бирор эритувчи ферментлар ёрдамида) эритмага ўтказиш йўли билан ажратилади. Эримайдиган оқсилларни соф ҳолда ажратиб олиш учун бошқа моддалар бирор усулда эритмага ўтказилади, оқсил эса каттик фазада қолади(масалан, ипакдаги фиброин оқсили). Оқсилларни биолагик материаллардан тулик ажратиб олиш учунтўқималарни хужайраларнинг девори бузилгунча эзиш керак. Бунда турли асбоблар ишлатилади. Тўқималарни эзишда энг кўп қўлланилади-ган асбоблардан бири турли хил гомогенизаторлардир. Улара текширилаётган материал жуда катта(минутига 8000 мартагача) тезликда айланадиган уткир пичоклар ёрдамида майдаланади. Материалларни майдалашда бошқа усуллардан ҳам фойдаланилади. Майдадаланган материаллардан оқсиллар кўпинча тузларнинг 8-10 % ли эритмаси ёрдамида ажратиб олинади. Оқсилларнинг кўпи тузли эритмаларда яхши эрийди. Оқсилларни ажратиб олишда аммоний сульфат тузлари кўп ишлатилади. рН оқсиллар эрувчанлигига кучли таъсир килишини хисобга олиб, тузлар буферли эритма шаклида ишлатилади. Туз эритмаларидан ташкари, сув, спиртли эритувчилар, кучсиз кислоталар, кучсиз ишкорлардан ҳам эритувчи сифатида фойдаланилади. Ўсимликларнинг вегетатив органларидан оқсил ажратиб олишда баъзан спирт-эфир аралашмаси ва фенол, ацетат кислота билан сув аралашмаси ҳам ишлатилади. Майдаланган материал таркибидаги оқсилни эритмага ўтказиш кўп вакт талаб қилади. Бунда оқсиллар эритмага бутунлай утиши учун уни оим аралаштириб туриш керак. Эримайиган оқсилларни тоза ҳолда ажратиб олишда унинг таркибидаги бошқа моддалар ҳам бирин-кетин ажратиб олинади. Ёғ ва ёғсимон моддалар ацетон, эфир, бензол ва бошқа органиқ эритувчилар ёрдамида,углеводлар эса формиат кислота ёрамида ажратилади. Натижада чўкмада соф ҳолдаги оқсил қолади. Эрувчан оқсилларни ўсимлик органларидан(уруг, барг, мевадан) соф ҳолда ажратиб олиш қийин. Чунки ўсимликлар тўқимасида турли оқсиллар бўлиб, эритмага хар қайси оқсилдан озми-кўпми утади. Улар турли усуллар билан бир-биридан ажратилади, натижада соф ҳолдаги оқсил хосил бўлади. Соф ҳолдаги оқсил дастлаб 30-йилларда олинган. хозир бир қанча соф оқсил ажратиб олинди. Оқсилларни фракцияларга ажратишда тузлар, органиқ эритувчилардан, электрофорез хроматография, молекуляр элаш ва бошқа усуллардан фойдаланилади. Оқсилларни туз эритмалари ёрдамида ажратиб олиш: Оқсилларнинг айримлари тузларнинг маълум концентрациядаги эритмаси чўкмага тушади, бошқалари эритмада қолади. Уларни турли тузлар ёрдамида чуктириш усули оқсилларнинг тузланиши дейилади. Эритмага маълум миқдорда туз қўшилса, оқсиллар алохида-алохида чўкмага тушади ва центрифуга ёрдамида ажратиб олинади. Уларни бундай йул билан ажратишдакўпинча аммоний сульфат тузидан фойдаланилади. Чунки бу туз бошқа тузларга нисбатан сувда анча яхши эрийди. Масалан, нўхат унидан тайёрланган эритма аммоний сульфат билан чала туйинтирил-ганда глобулинлар чўкмага тушади, қолган эритма туз ёрдамида ута туйинтирилса, альбуминлар чўкмага тушади. Оқсилларни изоэлектрик нуктада чуктириш: Окслларни бир-биридан ажратишда уларнинг изоэлектрик нуктасидан ҳам фойдалани-лади. Маълумки, оқсиллар изоэлектрик нуктада энг кам эрувчан бўлади, мухитнинг рНни узгартириш билан у ёки бу оқсилни чўкмага тушириш мумкин6, бошқа оқсиллар эса эритмада қолади. Оқсилларни органиқ эритувчилар ёрамида ажратишда метил ва этил спиртлардан кўп фойдаланилади. Бу усулда ажратиш жараёни паст хароратда (-5-10) олиб борилиши шарт. Чунки юқори харората органиқ эритувчилар таъсирида оқсиллар денатурацияга учрайди. Оқсилларни ажратишда адсорбцион хромотография усули кўп қўлланилади. Бу усулда оқсиллар аралашмасини бир-биридан ажратиш ёки бошқа бирикмалардан тозалаш учун уларнинг эритмаси адсорбент тулдирилган вертикал шиша колонка оркали ўтказилади. Адсорбент кальций фосфат, крахмал, целлюлоза ва унинг хосилалари, силикогель ва бошқа модалар ишлатилади. Адсорбцияланган оқсиллар элюция (ювиш) йули билан ажратиб олинади. Элюция учун тугри концентрация ва рНга эга бўлган тузлар эритмасидан фойдаланилади. Элювитлар махсус асбоблар ёрдамида шиша пробиркаларга оз-оздан йигилаи. Шу йул билан ажратиб олинган оқсиллар фракцияси аниқланиб, бир хил фракцияагилар бир-бирига кушилади ва улардан соф оқсил олинади. Оқсилларни ион алмашинувчи хромотография усулида ажратиш ҳам мумкин. Бу усула ион алмашинувчи модалар сифатиа таркибида гидрофил группа бўлган бирикмалар, масалан, целлюлоза кўп ишлатилади. Оқсилларни ажратишда, одатда, ДЭАЭ целлюлоза (анион алмашинувчи) ва КМ-целлюлоза (катион алмашинувчи) қўлланилади. Ион алмашинувчи колонкалараги боғланган оқсил аралашмаларини фракцияларга ажратиш учун рН ортиб (ёки камайиб) борувчи буфер эритмаларини колонка оркали ўтказиш керак. Оқсилларни ажратиша электрофорез усули ҳам кенг қўлланилади. Бу усул электр токи таъсирида эритмада оқсиллар хар хил тезликда харакат килишига асосланган. Оқсил молекулалари электр заряига эга бўлганлиги учун электр майдонида анодга ёки катодга томон харакат қилади. Уларнинг харакати таркибидаги заряд микдорига пропорционал, яъни заряд қанча кўп бўлса, харакат тезлиги ҳам шунча юқори бўлади. Молекулаларнинг шакли ва катталиги ҳам харакат тезлигига таъсир қилади. Оқсилларнинг молекуляр оғирлиги. Оқсиллар мухим юқори молекуляр бирикма бўлиб, уларнинг структураси юзлаб, хаттоки минглаб аминокислоталар колдигиан ташкил топган. Оқсилларнинг молекуляр оғирлиги 6000 дан 1000000 дальтонгача бўлиб, унан ҳам юқори булиши мумкин. Аксарият оқсил молекулалари оғирлиги 30000-50000 альтонни ташкил этиб, факат битта полепепти занжиран иборатир. Юқори молекуляр огирликка эга бўлган оқсиллар эса бир неча полипептид занжирлардан тузилган. Бундай оқсиллар олигалир оқсиллар дейилаи. Юқори молекуляр бирикмаларни хоссаларини урганиш учун уларнинг молекуляр оғирлигини аниқлаш керак бўлади. Шунинг учун бундай модаларнинг молекуляр оғирлигини аниқлаша бир неча усуллар ишлаб чикилганир.: Седиментация анализи, махсус гелларда хроматография ва электрофорез усуллари шулар жумласидандир. Оқсилларнинг молекуляр массасини седиментация усулида аниқлаш энг аниқ усул хисобланади. Бунинг учун текширилаётган оқсилнинг седиментация коэффициенти тез айлантириладиган аналитик ультроцентрифугада аниқланади. Модданинг молекуляр массаси қанча катта бўлса, у шунча тез чукади. Седиментация тезлиги молекуланинг шаклига ҳам боглик кўпчилик сеиментация коэффициенти 1-СОС орасидадир. Молекуляр массани ультрацентрифугалаш усулиди аниқлаша, кўпинча вактни кўп талаб килиши ва киммат баҳо аппаратлар кераклиги учун кейинги вактларда гельфильтрация ва гель электрофорез усулларидан фойаланилмока. Натрий додицель сульфат гель электрофорезида молекуляр массани аниқлашда бу гельнинг махсус хусусиятидан фойдаланилади. Додицелсульфат таъсирида оқсиллар денатурацияланади ва кичик бирликларга диссоциланади. Оқсилнинг додицел сульфат билан шундай комплекси хосил бўладики, алифатик додицел туркумлар косплексининг ичида, сульфокислота туркуми эса ташки юзасида жойлашади. Бундай комплексларнинг жами электр уки манфий бўлиб, бир хил говак гелларда молекуляр массага тескари мутаносиб тезликда силжийди. Бу гель оркали кичик молекулалар йирик молекулаларга караганда тезрок утади. Текширилаётган оқсилнинг молекуляр массаси унинг натрий додицил сульфат гелидан утиш тезлигини молекуляр массаларини маълум оқсиллар билан олдиндан колибрланган чизикка солиштириб аниқланади. Гельфильтрациядан оқсилнинг молекуляр массасини аниқлаш узаро тикилган полемер гели доначалари тулдирилган калонка эритма шаклида киритилган оқсилни ювиб чикариш учун сарф бўладиган суюклик хажми билан белгиланади. Калонкадаги гель доначалари сувни шимиб шишади ва кичик молекулалар унинг говакларига кириб тухтаб қолади ёки калонкадан утиши секинлашади. Йирик молекулалар эса тез утаверади ва уларни ювиб чикариш учун кам суюклик етарли бўлади. Молекула қанча йирик бўлса,шунча кам хажм, қанча кичик бўлса, мутаносиб равишда кўп хажмда суюклик билан ювилади. Молекуляр массанинг логарифмми билан элюмирлаш (ювиш) хажми V 2 орасида тугри мутаносиблик бор. Буни молекуляр массалари маълум бир неча оқсилнинг калонкаан утишини текшириб олинган калибровка чизигидан аниқланади. Оқсил молекулаларининг шакли. Оқсиларнинг физик кимёвий ва биологик хоссалари уларнинг молекулалари хаклига ҳам боглик. Оқсил молекулалари икки хил шаклда бўлади. Агар молекулалар толасимон тузилган бўлса, фибрилар оқсиллар ( fibrilla - тола) дейилади. Агар оқсил молекулалари юмалок ёки элипс шакла бўлса, глобуляр оқсиллар ( globul-шар) дейилади. Фибрилляр оқсилларга сочдаги кератин, ипакаги фиброин мускуллараги миозин оқсилари мисол бўлади. Бу хилдаги оқсилларнинг кўпи сува эримайи, балки чукади. Фибриллар оқсиллар молекуласи бутун полипептит занжир буйлаб бир-бири билан кундаланг вооро боглар оркали бирикади. Глобуляр оқсилларга сувда эрийиган оқсиллар кираи. Уларнинг кўпчилиги ферментлардан иборат. Ўсимликлар таркибидаги запас оқсиллар ҳам глобуляр оқсилларга киради. Оқсил молекулалари шартли равишда турли шаклларга булинади, шунинг учун глобуляр тузилишга эга бўлган оқсилларни фибрилляр шаклли оқсилларга киритиш мумкин. Оқсил молекулаларининг шакли турли усулларда, чунончи, ренгеноструктура анализи, электрон микроскопия ёрамида аниқланади. Оқсилларнинг амфотерлик хоссалари. Оқсил молекулалари таркибида эркин карбоқсил ва амин группалар бўлганлиги учун улар ҳам аминокислоталар сингари амфотерлик хоссага эга бўлиб, ҳам асос, ҳам кислота сифатида диссо-циланади. Сувли эритмаларда оқсил молекулалари биполяр ионлар (амифонлар) шаклида бўлади. Кислотали группаларнинг иссоциланиши натижасида эритмага Н+ ионлари NH2 группа билан бирикиб, ионлашган оқсил молекулалари хосил бўлади: NH2 NH3+ / / R === R \ \ COOH COO - биполяр ион Оқсил эритмасига суюлтирилган кислота қўшилса, таркибидаги кислотали группаларнинг диссоциланиши камаяди. Демак кислотали мухитда оқсил молекулалари мусбат зарядига эга бўлади ва электр майонида катодга томон харакат қилади: NH3+ NH3+ / / R + HCl === R + Cl - \ \ COO- COOH Оқсил эритмасига ишкор кушилганда эса унинг таркибиаги асосли группаларнинг диссоциланиши камаяи, бинобарин, ишкорий мухитда ортикча манфий заряга эга булаи ва электр майдониа анога томон харакат қилади: NH3+ NH2 / / R + NaOH == R + H2O + Na+ \ \ COO- COOH - Шундай килиб, мухит рН ни узгартириш билан оқсил молекуласининг зарядини ҳам узгартириш мумкин экан. Бирок маълум рНда оқсил молекуласи таркибидаги мусбат ва манфий зарядлар сони бир-бирига тенг бўлади. Натижаа оқсил молекуласининг умумий заряди нольга тенг бўлиб, бундай молекулалар электр майонида анога томон ҳам, катодга томон ҳам харакат килмайди. Оқсил молекуласи таркибидаги мусбат ва манфий зарядлар йигиндиси нольга тенг бўлган мухит рН оқсилларнинг изоэлекьрик нуктаси деб аталади. Оқсилларни изоэлектрик нуктаси уларнинг узига хос курсаткичларидан хисобланади. Эритманинг рН изоэлектрик нуктага тенг ёки унга якин бўлганда оқсиллар ута бекарор бўлади. Изоэлектрик нуктада оқсиллар энг кам эрувчан бўлади. Уларнинг эрувчанлиги билан изоэлектрик нуктаси уртасидаги боғланиш келтирилган. Изоэлектрик нуктада оқсилларнинг ковушкоклиги ҳам жуда паст бўлади ва улар осонлик билан чўкмага тушади. Оқсиллар денатурацияси. Оқсиллар турли таъсир натижасиа узининг табиий хусусиятларини йукотади. Бу ходиса оқсиллар енатурацияси деб аталади. Денатурация оқсилларнинг узига хос хусусиятларидан бири. Хозирги замон тушунчаларига кура, оқсиллар денатурацияси улар фазовий тузилишининг узгариши билан боглик. Оқсил молекуласи конформациясининг узгариши билан унинг шакли, солиштирма оптик активлиги, ёругликни ютиши, эрувчанлиги электрофоретик харакатчанлиги ва шунга ухшаш бошқа физик-кимёвий ва биологик хоссалари ҳам узгараи. Тухум оқсили иситилганда котиб колиш денатурацияга яккол мисолдир. Денатурация натижасида оқсил молекуласининг фазовий структурасини белгилайдиган турли хил боглар, асосан, водород ва дисульфид боглар бузилади. Шу сабабли натив холатдаги оқсил молекуласининг айрим кисмлари ва молекулалари орасиаги мустахкам структура ҳам маълум таркибдаги денатурация процессида узгаради. Денатурация хоисасини келтириб чикадиган факторлар орасидаги энг мухими хароратдир. Кўпчилик оқсиллар 45-50 градуса денатурацияга учрайди. Ута кислотали ва ута ишкорий мухитда еярли барча оқсиллар 37 градусда енатурацияга учрайди. Оқсиллар огир метал тузлари, кислоталар, ишкорлар, ультробинафша ва ионлаштирувчи нурлар таъсирида ҳам денатурацияга учрайди.Оқсиллар денатурацияси хаётий жараёнларда мухим аҳамият касб этади. Организмнинг кариши ундаги оқсилларнинг аста-секин енатурацияга учраши билан боглик. Бирор ўсимликнинг уруги маълум вакт утгандан кейин униш кобилиятини йукотишга ҳам денатурацияси сабаб бўлади. Оқсилларнинг кайтар денатурацияси ҳам хаётий жараёнларда катта аҳамиятга эга бўлиб, бунда уларнинг молекулалари бир шаклдан иккинчи шаклга утиб туради. Ферментларнинг фаол ва нофаол холатларда булиши кайтар денатурация ходисаси билан боглик. Оқсиллар молекуласидаги кимёвий боглар. Оқсиллар молекуласида турли функционал группалар бўлган жуда кўп аминокислоталар колдигидан ташкил топган. Шунинг учун натив оқсиллар молекуласи таркибида учрайдиган кимёвий богларни аниқлаш бирмунча қийин. Текширишлар натижасида куйидаги боглар мавжудлиги аниқланган. Пептид боглар: Оқсиллар молекуласини ташкил этадиган аминокислоталар бир-бири билан пептид боглар (-CO-NH-) оркали боғланган. Пептид боглар бир аминокислотанинг амин группаси билан узаро реакцияга кириши натижасида хосил бўлади. Бу реакцияда бир молекула сув ажралиб чикади. Масалан, аланин билан глицин узаро реакцияга киришиши натижасида куйидаги пептид бог хосил бўлади: CH3 ! - H2O H2N-CH-COOH + H-N-CH2-COOH ====== ! аланин H глицин CH3 ! == H2N-CH-CO-NH-CH2-COOH аланилглицин (дипептид) Пептидлар таркибидаги аминокислота колдигининг сонига караб дипептид, трипептид, тетропептид деб аталади ва хаказо. Агар пептидлар жуда кўп аминокислоталардан ташкил топган бўлса, полипептид деб юритилади. Тирик организмларда эркин ҳолда жуда кўп пептидлар учрайди. Улар моддалар алмашинуви процессида мухим аҳамиятга эга. Хозиргача тирик организмлардан 120 га якин пептид ажратиб олинган бўлиб, уларнинг тузилиши, хусусиятлари, биологик фаоллиги хар томонлама урганилган. Буларга аввало ўсимликлардаги оксидланиш кайтарилиш жараёнларида фаол иштирок этадиган глютатион киради: NH2 CH25H ! ! HOOC-CH-CH2-CH2-CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOH глютамин кислота цистеин глицин Глютатион учта аминокислотанинг: глютамикислота, цистеин ва глиценнинг бирикишидан хосил бўлган трипептиддир. Улар барча ўсимликларда айникса бугдой донида ва ачитки замбуругларида кўп учрайди. Кофермент А-дан хисобланади. У пантион кислоталар билан В-аланилнинг узаро бирикишидан хосил бўлади. Кўпгина антибиотиклар (грамидицин, пеницилин ва бошқалар) ҳам пептид хисобланади. Рус биокимёгари А.Я. Данилевский оқсил таркибидаги аминокислоталар бир-бири билан -HN-CO- бог оркали бириккан деб тахмин қилади. Немис олими Э.Фишер Данилевский тахминига асосланиб оқсил молекулаларининг тузилиши тугрисидаги полипептид назарияни яратди. Оқсилларнинг тузилиши тугрисидаги хозирги замон тушунчалари Фишернинг ана шу назариясига асчосланган. Бу назарияга кура, оқсил молекулалари унлаб, юзлаб аминокислота колдикларидан ташкил топган жуда катта полипептид занжирларидан иборат. Масалан, инсулин гармони-51, рибонуклеза ферменти-124, лизоцин ферменти -129 та аминокислотадан ташкил топган полипептид хисобланади. Оқсил молекуласида пептид боглар мавжудлиги кўпгина далиллар билан исботланган. Пептид боглар оқсил молекуласидаги асосий ва ковалент бог бўлганлиги учун мустахкам бог хисобланади. Бу бог L-аминогруппа билан ёнма-ён турган карбоқсил группадан хосил бўлганлиги учун полипептид занжирнинг асосини кайта-кайта келадиган бир хил -CO-NH- группа ташкил қилади. полипептид занжирдаги бу группалар бир текисликда жойлашган. Уларнингёйик конфегурацияси, яъни фазовий жойлашиши 9-расмдаги схемада курсатилган. Хар хил оқсилларнинг полипептид занжирлари бир-биридан R-радикалларнинг характерига караб фарк қилади. Бу радикаллар полипептид занжирнинг атрофини ураб олган улар турли кимёвий хоссаларга эга. Буларга ароматик углеводли радикаллар (фенилаланин, терозин), гетерокиклик радикаллар (пролин, трифтофан киради) кўп аминокислоталарнинг радикаллари эркин амин(лизин, аргинин), эркин карбоқсил (глутамат кислота), гидроқсил (серин, треонин), тиол (цистеин), амид (аспарагин, глутамин) ва бошқа функционал группалардан ташкил топган. иришиш кобилиятини яада оширади. |