|
|
Биохим_15. Учебное пособие Хабаровск 2015 методические указания составили поступаев валерий Васильевич, д м. н., профессор
№
| Вопросы, подлежащие изучению |
Последовательность работы
и способ оформления результатов
|
1.
| Химические реакции, с помощью которых можно обнаружить белок и выявить различия в аминокислотном составе белков.
|
Проделать с яичным белком и желатином биуретовую реакцию, нингидриновую реакцию, реакцию нитрования, реакцию Фоля, и реакцию Адамкевича.
Биуретовая реакция на белки.
Принцип: В щелочной среде раствор белка при добавлении разбавленного раствора сульфата меди окрашивается в сине-фиолетовый цвет. Окраска обусловлена образованием комплексов ионов меди с пептидными группами белка.
Биуретовую реакцию дают все белки, а также олигопептиды, содержащие не менее двух пептидных связей.
Ход работы: В одну пробирку наливают 5 капель раствора яичного белка, во 2-ю – раствора желатина. В каждую пробирку добавляют по 5 капель 10% раствора гидроксида натрия (NaOH) и по 1 капле 1% раствора сульфата меди (CuSO4). Во всех пробирках наблюдают устойчивое сине-фиолетовое окрашивание.
2. Нингидриновая реакция.
Принцип: Реакция характерна для аминогрупп, находящихся в альфа-положении и входящих в состав белков, полипептидов и свободных аминокислот. Аминокислоты, полипептиды и белки при кипячении с водными растворами нингидрина дают синее или сине-фиолетовое окрашивание. В результате взаимодействия альфа-аминокислоты с нингидрином образуется Шиффово основание, которое перегруппировывается, декарбоксилируется и расщепляется на альдегид и аминодикетогидринден.
Ход работы: К 5 каплям растворов каждого белка добавляют 5 капель 0,5% водного раствора нингидрина и кипятят 1-2 мин. В пробирке развивается розово-фиолетовое окрашивание, а с течением времени раствор синеет.
3. Реакция на ароматические аминокислоты (реакция нитрования, ксантопротеиновая реакция).
Принцип: При нагревании с крепкой азотной кислотой растворы белка дают жёлтое окрашивание. Реакция обусловлена наличием в белках циклических аминокислот (фенилаланина, тирозина, триптофана) и основана на образовании нитропроизводных этих аминокислот.
После подщелачивания раствором NH4OH жёлтое окрашивание переходит в оранжевое (образуются аммонийные соли хиноидной структуры).
Реакцию с азотной кислотой дают почти все белки, за исключением некоторых, в которых отсутствуют названные выше аминокислоты.
Ход работы: В одну пробирку наливают 5 капель раствора яичного белка, во вторую – раствора желатина. Во все пробирки добавляют по 3-5 капель концентрированной азотной кислоты (HNO3) и нагревают. В первой пробирке образуется белый осадок, который при нагревании окрашивается в жёлтый цвет и постепенно растворяется (происходит гидролиз белка), сообщая жёлтую окраску раствору. Пробирки охлаждают, к охлаждённым растворам прибавляют (осторожно) по 10 капель концентрированного раствора аммиака или 30% раствора гидроксида натрия (NaOH) и наблюдают изменение окраски растворов вследствие образования аммонийной соли динитротирозина.
4. Реакция на цистеин (реакция Фоля).
Принцип: При добавлении к раствору белка раствора гидроксида натрия, ацетата свинца и последующем кипячении раствор начинает темнеть. Реакция обусловлена присутствием в белке цистеиновых и полуцистеиновых остатков, которые при нагревании в присутствии крепкой щёлочи разрушаются с образованием сульфида натрия.
Ацетат свинца реагирует со щёлочью с образованием плюмбита натрия. Сульфид натрия при взаимодействии с плюмбитом даёт чёрный осадок сульфида свинца.
Ход работы: В две пробирки, содержащие по 5 капель исследуемых белков, добавляют по 5 капель 30% раствора гидроксида натрия и по 1 капле 5% раствора ацетата свинца. При интенсивном кипячении жидкость в пробирках с яичным белком темнеет, так как образуется чёрный осадок сульфида свинца. В пробирке с желатином чёрного осадка не образуется, так как желатин не содержит серосодержащих аминокислот.
5. Реакция Адамкевича на триптофан.
Принцип: Реакция обусловлена наличием в белке аминокислоты триптофан, который, реагируя с глиоксилевой кислотой, присутствующей в виде примеси в концентрированной уксусной кислоте, даёт окрашенные продукты конденсации. Концентрированная серная кислота принимает участие в реакции в качестве водоотнимающего средства.
Ход работы: В две пробирки, содержащие по 5 капель исследуемых белков, добавляют по 5 капель концентрированной уксусной кислоты, слегка нагревают и затем подслаивают, добавляя по 10 капель концентрированной серной кислоты. При наличии в белке триптофана на границе двух слоёв жидкости появляется красно-фиолетовое кольцо, постепенно распространяющееся на всю жидкость.
|
2.
| Определить сходство и различие изучаемых белков по аминокислотному составу.
|
Сравнить полученные результаты.
Результаты опытов внести в таблицу:
№
|
Название реакции
|
Исследуемые белки
|
Ок-рас-ка
|
Чем
обусловлена
реакция
|
Яичный
белок
|
Же-латин
|
|
|
|
|
|
|
Сделать вывод: а) о степени специфичности цветных реакций на белки и аминокислоты, б) об особенностях аминокислотного состава яичного белка и желатина.
|
|
|
|
Скачать 2.47 Mb.