|
|
Биохим_15. Учебное пособие Хабаровск 2015 методические указания составили поступаев валерий Васильевич, д м. н., профессор
Вопросы и задания для самоподготовки
Рассмотрите основные различия в действии неорганических катализаторов и ферментов.
Изучите методы, с помощью которых можно доказать белковую природу ферментов.
Выясните, почему присутствие фермента снижает энергетический барьер реакции.
Рассмотрите роль активного центра в реакциях ферментативного катализа.
Рассмотрите химическую природу ферментов, поясните, какие компоненты могут входить в состав сложных ферментов. Выучите коферменты, являющиеся производными витаминов группы В.
Нарисуйте схему образования фермент-субстратного комплекса.
Выясните, что такое аллостерический центр, объясните механизм изменения ферментативной активности при воздействии аллостерических эффекторов.
Выясните принцип классификации ферментов. Нарисуйте и дополните таблицу 2, отражающую классификацию ферментов, дополнив ее конкретными примерами.
Таблица 2
Классификация ферментов
-
Порядковый № класса
| Название класса | Характер реакции |
Пример
|
1
|
Оксидоредуктазы
|
Окислительно-восстановительные
реакции
|
Каталаза
2Н2О2О2 + Н2О
|
2
|
|
|
|
3
|
|
|
|
4
|
|
|
|
5
|
|
|
|
6
|
|
|
|
Рассмотрите примеры различной специфичности ферментов (абсолютная, относительная, стереохимическая).
Выясните принцип обнаружения ферментов в биологических объектах, единицы ферментативной активности.
Ориентировочная карта действия
№
| Вопросы, подлежащие изучению |
Последовательность работы
и способ оформления результатов
|
1.
|
Качественное обнаружение ферментов в биологических объектах.
|
1.Уреаза - фермент, катализирующий гидролиз мочевины с образованием аммиака и углекислого газа.
К 2 мл 2% раствора мочевины добавить, помешивая, 0,5 г соевой муки. Через несколько минут по запаху обнаруживается появление аммиака. При прибавлении в пробирку 2 капель раствора фенолфталеина наблюдается появление розового окрашивания вследствие сдвига реакции в щелочную сторону.
2. Тирозиназа - фермент, катализирующий первую стадию окисления тирозина и других производных фенола в окрашенные меланиноподобные вещества.
К 2 мл 1% раствора тирозина добавить 0,5 мл водной вытяжки картофеля, поставить в термостат (температура 37°С).
3. Каталаза- фермент, катализирующий реакцию разложения пероксида водорода на молекулярный кислород и воду.
В пробирку налить 10-15 капель 1% раствора пероксида водорода, добавить 1 каплю крови. Происходит бурное выделение пузырьков кислорода, жидкость вспенивается.
4. Пероксидаза - фермент, катализирующий реакцию окисления фенолов, полифенолов, ароматических аминов в присутствии пероксида водорода.
В две пробирки налить по 5 капель гваяковой смолы и по 5 капель 2% раствора пероксида водорода. В первую пробирку добавить 5 капель вытяжки из хрена во вторую (контроль) - 5 капель воды. Наблюдать изменение окраски (синий цвет).
5. Амилаза – фермент, катализирующий гидролитическое расщепление крахмала с образованием мальтозы (промежуточными продуктами могут быть различные декстрины).
В пробирку набрать 1 мл разведенной слюны (1:10), прилить 1 мл 1% раствора крахмала. Инкубировать в термостате 15 мин при 37°С. Пробу разлить поровну в 2 пробирки. В первой пробирке провести пробу Троммера (на наличие продукта реакции – мальтозы или глюкозы); во второй провести цветную реакцию с 1% раствором J2 в KJ (при наличии субстрата – крахмала – наблюдается синее окрашивание).
Проба Троммера: к 5 каплям инкубационной смеси добавить 1 мл 10% раствора гидроксида натрия и 1-3 капли 1% раствора сульфата меди (II) до появления неисчезающей мути. Жидкость перемешивают и нагревают на водяной бане до начала кипения. Выпадает красный осадок оксида меди (I) или жёлтый осадок гидроксида меди (I), вследствие окисления глюкозы и восстановления Сu(OH)2 до Cu2O (положительная проба Троммера, - в присутствии глюкозы и мальтозы).
Протокол оформить в виде таблицы, в которой указать: источник фермента, субстрат, на который он воздействует и продукты, по которым обнаруживается действие фермента.
|
2.
|
Определение специфичности сахаразы
|
Принцип метода: Фермент сахараза катализирует гидролитическое расщепление сахарозы с образованием глюкозы и фруктозы.
Действие сахаразы можно обнаружить по появлению в инкубационной среде свободной глюкозы, дающей положительную качественную реакцию Троммера вследствие наличия в молекуле глюкозы свободного полуацетального гидроксила. Сахароза этой реакции не даёт, так как полуацетальный гидроксил в её глюкозном остатке участвует в соединении с фруктозой.
Ход работы: 1. Для получения сахаразы из дрожжей навеску 0,5 г высушенных пекарских дрожжей тщательно растирают в ступке для разрушения дрожжевых клеток, затем добавляют 5 мл воды и растирают дрожжи с водой. Полученную суспензию фильтруют через складчатый фильтр. Фильтрат содержит фермент сахаразу.
2. Готовят две инкубационные смеси, как указано в таблице, используя в качестве субстрата сахаразы два вещества: сахарозу и крахмал.
|
|
|
№ про-бы
|
Фермент (сахараза), мл
|
Раствор сахаро-зы, мл
|
Раствор крахмала, мл
|
Реакция Троммера
(+ или –)
|
1
|
1
|
1
|
–
|
|
2
|
1
|
–
|
1
|
|
Пробирки выдерживают в термостате 15 мин при 38 ºС, затем выполняют пробу Троммера (выполнение пробы Троммера – см. работу «Обнаружение амилазы»).
Сделать вывод о специфичности сахаразы дрожжей.
|
|
|
|
Скачать 2.47 Mb.