Практикум Люта. В. Л. Люта о. В. Кононов в а. Люта о. В. Кононов
 Скачать 1.23 Mb.
|
|
1. Ознайомлення з методами культивування вірусів, їх індикації та ідентифікації Завдання 1. Ознайомтеся з методами культивування вірусів, їх індикації та ідентифікації. Культивування вірусів у вірусологічних лабораторіях проводять з метою виділення їх з клінічного матеріалу і подальшої ідентифікації, а також для культивування лабораторних штамів збудника, приготування діагностичних препаратів та отримання вакцин. Виділення вірусів потребує багато часу (2—4 тиж) і значних матеріальних витрат. Для культивування вірусів у сучасних вірусологічних лабораторіях використовують культури клітин і курячі ембріони. Виділення вірусів на культурах клітин. Культури клітин бувають первинно-трипсинізовапі (первинні), перещеплювані та диплоїд ні. Первинні культури клітин отримують із тканин людини чи тварини. Для цього шматочки тканин або цілі органи вміщують у 0,25 % розчин трипсину за температури 37 С і перемішують па магнітній мішалці. Трипсин розщеплює міжклітинну тканину, внаслідок чого тканина або орган розпадається на окремі клітини, тому їх ще називають первинно-тринсинізованими. Через кожні 20—ЗО хв завис клітин відділяють у центрифужні пробірки. Після центрифугування трипсин зливають, а до клітин додають поживне середовище, в якому клітини зберігають свою життєздатність. Ці культури клітин можуть розмножуватися in vitro, зазнають близько 10 поділів, а потім гинуть. Для отримання первинних клітин найчастіше використовують нирки ембріона людини (клітини називають НЕЛ), нирки макаки-резус, африканської зеленої мавпи, ембріона свині, фібробласти курячих ембріонів. Перещеплювані культури клітин — це клітини одного типу, що набули здатності до необмеженого росту. їх отримують із пухлий або з нормальних тканин людей чи тварин, що мають змінений каріотип. Практичні лабораторії отримують перещеплювані клітинні лінії від центральних банків клітинних культур науково-дослідних інститутів. Із перещеплюваних клітинних культур найчастіше використовують такі: HeLa (клітини, отримані з тканин карциноми шийки матки), Нер-2 (із карциноми гортані), KB (із карциноми ротової порожнини), RH (з нирок ембріона людини), Vero (з нирок зеленої мавпи), MDCK (з нирок собаки), SIRC (клітини рогівки кролика). Диплоїдні клітини — цс клітини одного типу, які здатні витримувати in vitro близько 100 поділів, зберігаючи при цьому вихідний диплоїдний набір хромосом. За визначенням Міжнародного комітету з культур клітин, штамом диплоїдних клітин називається морфологічно однорідна популяція клітин, стабілізована в процесі культивування in vitro, яка має обменсений термін життя і характеризується трьома фазами (фаза стабілізації, активного росту і старіння), зберігає у процесі пасивування каріотип, властивий вихідній тканині, вільна від контамінаптін (забруднення будь-якими мікроорганізмами) і не має онкогенної активності. їх отримують із ембріона людини. Ці культури надзвичайно вибагливі до умов культивування, тому їх рідко застосовують у практиці вірусологічних лабораторій. їх використовують здебільшого у виробництві вакцин. Для отримання культур клітин застосовують поживні середовища. Вони бувають ростові та підтримувальні. Ростові середовища сприяють розмноженню клітин, їх швидкому росту і утворенню добре сформованих моношарів. Для їх виготовлення використовують стандартні середовища Ігла, Ігла MEM, подвійне середовище 199 та ін. Ці середовища містять оптимальний набір амінокислот, солей, вітамінів, необхідних для підтримання ЖИТТЄДІЯЛЬНОСТІклітин. До них додають 10 % інактивовапої стерильної сироватки крові великої рогатої худоби чи ембріональної телячої сироватки. Підтримувальні середовища використовують для підтримання життєдіяльності клітин в уже сформованому моношарі з метою забезпечення умов для репродукції вірусів. Для цього використовують ті самі стандартні середовища, але без сироватки, або додають її не більше ніж 2 %. Для пригнічення росту бактерій і цвільових грибів у середовища безпосередньо перед їх використанням додають антибіотики: пеніцилін, стрептоміцин (по 100 мкг/см3). Клітинні культури використовують у вигляді суспензії або моношару на поверхні скла у флаконах, матрацах, пробірках. Для отримання моношару у стерильний посуд вносять певний об'єм (залежно від розміру посуду) суспензії клітин, додають середовище росту і ставлять у термостат за температури 37 °С. Формування моношару відбувається протягом 48 год. Потім середовище росту видаляють, мопошар промивають розчином Хенкса(це збалансований сольовий розчин, який використовують для виготовлення поживних середовищ росту і підтриму-вальних середовищ, а також для промивання клітин, тканин і для транспортування вірусовмісного патологічного матеріалу). Потім вносять 0,1 чи 0,2 см;і (залежно від розміру посуду) вірусовмісного матеріалу і витримують у термостаті за температури 37 С 1—2 год для адсорбції вірусу на клітинах. Після цього досліджуваний матеріал зливають, моношар промивають розчином Хснкса для видалеппя токсичних компонентів, заливають підтримувальним середовищем і витримують у термостаті за температури 37 °С 7—17 діб до визначення результатів. Іпдикацію вірусів у культурі клітин здійснюють на підставі змін, що виникають у процесі їх репродукції. До таких змін належать:
Причиною інтерференції є неспроможність вірусу проникати у клітину, заражену іншим видом вірусу.  Виділення вірусів на курячих ембріонах (мал. 9). Перевагою курячих ембріонів є їх доступність для будь-якої вірусологічної лабораторії, порівняна дешевизна і простота в роботі. Використовують курячі ембріони (КЕ) віком від 5 до 12— 14 діб. Вік ембріонів, спосіб їх зараясення та термін отримання максимальної кількості вірусів залежать від біологічних властивостей вірусів і їх тропізму. Перед зараженням курячі яйця витримують у термостаті за температури 37 °С і 60—70 % відносної вологості (у термостат ставлять лотки з водою). Щоб ембріональні оболонки не злипалися, яйця в термостаті повертають кілька разів на добу. Через деякий час, коли розів'ються ембріони, яйця овоскопують для визначення життєздатності ембріонів. Показником їх життєздатності є наявність самостійних рухів, добре виражений судинний малюнок, пульсація судин. Під час овоскопії на шкаралупі роблять позначки (межу повітряного мішка, місце розміщення ембріона — "темне око" ембріона тощо). Існує декілька способів зараження курячого ембріона: у амніотичну й алантоїсну порожнини, у жовтковий міхур, на хоріоналантоїсну оболонку. Перед зараженням шкаралупу яйця протирають запаленим спиртовим тампоном і 2 % спиртовим розчином йоду. Стерильною голкою для внутрішньом'язових ін'єкцій у шкаралупі роблять прокол і вводять у ембріон 0,1—0,2 см3 досліджуваного матеріалу. Для дослідження одного виду матеріалу заражають не менше ніж 4 курячих ембріони. Отвір від голки закривають парафіном або лейкопластирем. Після зараження ембріони інкубують у термостаті, розміщуючи їх тупим кінцем догори. Температура і тривалість інкубації залежить від біологічних властивостей вірусу. Після закінчення інкубації ембріони охолоджують для максимального звуяссння кровоносних судин: за температури -10...-18 С протягом 1—2 год або при 4 С протягом 16—18 год. Розтин курячого ембріона проводять у стерильних умовах. Охолоджені яйця вміщують на підставку тупим кінцем догори, дезінфікують шкаралупу спиртом і розчином йоду, потім вирізають у ній отвір над повітряним простором вище за позначену його межу. Ідентифікацію вірусу проводять лише за допомогою серологічних реакцій. Для цього використовують реакцію ІФЛ, РІА, РГГА, РН, РЗК та ін. 2. Ознайомлення з методами взяття матеріалу при вірусних інфекціях, упаковкою та умовами його транспортування до лабораторії Завдання 2. Ознайомтеся з методами взяття матеріалу при вірусних інфекціях. Важливою умовою успішного виділення вірусу є правильний відбір патологічного матеріалу і транспортування його до лабораторії. Відбирати матеріал слід у найбільш ранні строки після початку захворювання (при грипі — у перші 2 доби; в осіб, які контактували з хворим, — до появи у них симптомів інфекції; секційний матеріал — відразу після констатування факту смерті хворого). Під час відбору проб слід дотримуватися правил асептики та техніки безпеки. Під час проведення маніпуляцій, які супроводжуються порушенням цілості шкіри та слизових оболонок, лабораторних досліджень, оброблення інструментарію і білизни, прибирання, розтину трупів тощо медичні працівники і технічний персонал користуються засобами індивідуального захисту (хірургічними халатами, гумовими рукавичками, масками, а в разі потреби — захисним екраном, непромокальними фартухами, нарукавниками, окулярами). Ці дії дають змогу уникнути контакту шкіри та слизових оболонок працівника з кров'ю, тканинами, біологічними рідинами пацієнта. Матеріал відбирають у стерильний посуд. Для цього використовують пробірки з кришками, що загвинчуються. Для запобігання забрудненню матеріалу бактеріальною мікрофлорою його відбирають в умовах, що максимально наближепі до стерильних. Щоб запобігти підсиханню матеріалу й інактивації збудника, проби рекомендують вміщувати у транспортувальне середовище для вірусів (ВТС). До складу ВТС входять: розчин Хенкса (pli 7,4), захисний стабілізуючий агент — сироватковий альбуміїс великої рогатої худоби, пеніцилін, стрептоміцин і індикатор — феноловий червоний. Тип проби визначається характером захворювання, троппістю збудника до певних органів і систем та періодом перебігу інфекційного процесу. При ГРВІ відбирають назофарингеальні зразки, що містять циліндричні епітеліальні клітини носа і ротоглотки. Назофарингеальні зразки можна взяти одним із трьох способів: полосканням, аспірацією або за допомогою тампона. Під час полоскання хворому рекомендують старанно прополоскати горло 15—20 см:і розчину Хенкса або середовища 199, Ігла протягом 1 хв і зібрати змив у стерильний флакон. Для полоскання можна використати стерильний забуферсний ізотонічний розчин натрію хлориду, а потім внести його у ВТС. Під час аспірації шприцом через надітий на нього тонкий гумовий зонд у ніс вводять декілька сантиметрів кубічних стерильного ізотонічного розчину натрію хлориду, потім цю рідину відсмоктують, вміщують у цептрифужну пробірку з ВТС і загвинчують кришку пробірки. Найчастіше матеріал відбирають за допомогою тампона. Для цього треба мати для одного хворого 2 стерильних сухих ватних (або марлевих) тампони окремо для носа та для ротоглотки. Перед взяттям матеріалу проводять маркіруванпя пробірок з транспортувальним середовищем для вірусів. Спочатку ніс звільняють від слизу. Потім сухий стерильний тампон вводять у порожнину носа хворого по зовнішній стінці, злегка опускають донизу, вводять у нижній носовий хід на глибину 2—3 см, натискають тампоном на зовнішню стінку носа і обертовим ру хом знімають десквамонаний епітелій (епітелій, що злущується з поверхні тканини). Потім тампон опускають у пробірку з 2 см3 середовиїца ВТС або фосфатного буферного розчину. Другим стерильним тампоном протирають слизову оболонку задньої стінки глотки (докладаючи зусиль, щоб зняти частину епітеліальних клітин). Тампоп вміщують у ту саму пробірку з ВТС, закривають пробкою і маркірують. Пробірку з матеріалом охолоджують у холодильнику до 4 °С і доставляють до лабораторії в термосі з льодом, не допускаючи заморожування (при грипі — не пізніше 4 год). У лабораторії ВТС центрифугують 20 хв при 2—3 тис. об/хв і за температури 4 "С. Надосадову рідину використовують для зараження курячих ембріонів і культур клітин, а осад — для проведення імунофлюоресцентної мікроскопії. Інший патологічний матеріал відбирають перевалено за загальноприйнятими методиками, але є деякі особливості. Спинномозкову рідину відбирають у кількості 1—2 см3, домішки еритроцитів і інших клітинних елементів видаляють центрифугуванням, віруси виділяють з надосадової рідини. Проби калу відбирають у стерильні флакони з-під пеніциліну, масою 8—10 г (розміром з кісточку сливи). Флакони щільно закривають гумовими пробками. Отримані фекалії розводять розчином Хенкса у співвідношенні 1:10. Для отримання рівномірної суспензії флакон загортають у серветку, яка змочена 70 % розчином етилового спирту, струшують протягом З—5 хв і центрифугують. Для виділення вірусу відбирають надосадову рідину. Якщо матеріал відбирають ректальним тампоном, його попередньо змочують у ВТС, вводять у пряму кишку обертальним рухом. Після взяття матеріалу тампон вміщують у пробірку з ВТС, відмивають, віджимають і занурюють у дезінфекційний розчин. Отриману завись у пробірці обробляють так само, як суспензію калу. Кров на вірусологічне дослідження беруть із вени в об'ємі 5—10 см3, краще під час гарячки. Для запобігання згортанню кров дефібринують (струшують зі скляними паличками або додають 1 МО гепарину на 1 см3 крові). Нсрозвсдену кров не заморожують і антибіотики не додають. Кров на серологічне дослідження беруть у об'ємі 3—5 см3. Для отримання парних сироваток кров беруть з інтервалом 12—14 діб: першу пробу на початку захворювання, другу — через 2 тиж. Для отримання сироватки крон поміщають у термостат за 37 С, утворений згусток відділяють від стінок пробірки скляною паличкою або пастерівською пінеткою. Для збільшення виходу сироватки пробірки із кров'ю, що згорнулася, ставлять у холодильник за температури 4 С на 18—24 год. Для видалення решти домішок кров центрифугують, потім сироватку переносять у стерильну пробірку і зберігають у замороженому стані до отримання другої проби. Дві проби сироватки досліджують одночасно. Сеча. Збирають середню порцію сечі в об'ємі 10 см3, охолоджують до 4 °С, центрифугують, надосадову рідину виливають у дезінфекційний розчин, а осад вміщують в 1 см3 ВТС. Осад у ВТС зберігають за 4 С протягом не більше ніж 48 год перед доставкою до лабораторії. В іншому випадку його заморожують у ВТС за -70 "С і відправляють у пакетах із сухим льодом. Рідипу із серозних оболонок беруть в об'ємі 2 см3. Для виділення вірусів її використовують відразу (додаткового оброблення не потребує) або зберігають замороженою. Мазок із кон'юнктиви беруть сухим стерильним тампоном і вміщують у ВТС. Після центрифугування використовують відразу або зберігають замороженим. Вміст везикул. Поверхню шкіри обробляють ефіром або ацетоном. Вміст везикул відсмоктують шприцом із тонкою голкою і переносять у ВТС. Іноді везикули розтинають і вміст відбирають стерильним ватним тампоном, який вміщують у ВТС. Секційний матеріал відбирають у найбільш ранній термін після смерті хворого. Щоб уникнути контамінації матеріалу бактеріальною мікрофлорою, матеріал відбирають у певній послідовності. Спочатку беруть проби иозапорожнинних тканин (лімфатичні вузли, мозок), потім тканини грудної порожнини (до початку розтину черевної порожнини) і в останню чергу — з черевної порояснини. Шматочки тканин масою 1—3 г поміщають у окремі стерильні флакони. Отримані шматочки тканин розтирають у стерильній ступці з додаванням стерильного піску, додають розчин Хенкса у співвідношенні 1:10, центрифугують. До освітленої рідини додають антибіотики і використовують для виділення вірусів негайно або зберігають за температури 20 °С. На санітарно-вірусологічне дослідження відбирають матеріал з довкілля: ґрунт, воду, молоко і молочні продукти, овочі, фрукти, а також тварин, в організмі яких можуть перебувати віруси (кліщі, молюски, риба тощо). Здійснення вірусологічного нагляду за об'єктами навколишнього середовища потрібне для визначення інтенсивності циркуляції вірусів на певпій території, їх типового складу, оцінки ефективності роботи щодо оздоровлення навколишнього середовища. Завдання 3. Ознайомтеся з упаковкою та умовами транспортування вірусовмісного матеріалу до лабораторії. Для транспортування до вірусологічної лабораторії вірусовмісний матеріал упаковують у пробірки, які щільно закривають кришками, що закручуються. Крім того, верх пробірки разом із кришкою заклеюють водонепроникною клейкою стрічкою або лейкопластиром. Цю пробірку нотім поміщають у иластиковий пакет разом із невеликою кількістю адсорбівного матеріалу (наприклад, ватою). Пластиковий пакет закривають на "замок" або заклеюють чи запаюють. Всі матеріали мають бути двічі упаковані, тому підготовлені пакети поміщають у пластикові пакети більшого розміру. Якщо від одного пацієнта відбирають декілька зразків, їх пакують окремо у пакети меншого розміру, а потім всі зразки можна помістити в пакет більшого розміру. Зразки, отримані від різних пацієнтів, пакують окремо в різні пакети більшого розміру. Зразки, що упаковані у 2 пластикових пакети, поміщають у пластиковий транспортний контейнер і закривають кришкою, що закручується. Верхню частину контейнера і кришку заклеюють лейкопластиром. Двічі упаковані зразки від одного чи різних пацієнтів транспортують в одному пластиковому контейнері. У цей контейнер також поміщають адсорбівний матеріал. Направлення приклеюють до зовнішньої стінки контейнера (мал. 10). Щільно закриті, із заклеєними кришками контейнери поміщають у термоізолюючий контейнер, який пристосований для транспортування біологічних матеріалів (мал. 11). Упаковка зразків має повністю відповідати спеціальній інструкції міжнародного агентства LATA № 650 з упаковки і транспортування небезпечних вантажів. У термоізолюючому контейнері мають знаходитися заморожені холодильні елементи або інші пластикові пакети з льодом  Кришка контейнера
Герметично упаковані пакети більшого розміру із зразками — Адсорбівний матеріал ■ • - ; і- Герметично упакований пакет меншого розміру із зразком |