|
Билет 1. Вопрос Ингалипт
Билет 31. Вопрос 1 . Инсулин применяют при сахарном диабете I типа — инсулинзависимым диабетом (ИЗСД)
В 70-е гг. 20 в. шло прогрессирующее улучшение степени очистки инсулинов, что уменьшило проблемы, обусловленные инсулиновой аллергией, нарушениями работы почек, расстройством зрения и иммунной резистентностью к инсулину. Со времени открытия и до начала 80-х гг. использовали инсулин, получаемый из поджелудочной железы КРС и свиней. Инсулин КРС отличается тремя аминокислотами, свиной -одной аминокислотой от инсулина человека. Наиболее эффективный гормон для заместительной терапии при сахарном диабете - гомологичный инсулин, т.е. инсулин человека.
В 1980 г. датская фармацевтическая компания «Novo» разработала метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека ферментативным замещением аланина, последний является 30-й аминокислотой в цепи В, на остаток треонина с последующей хроматографической очисткой продукта, в результате был получен однокомпонентный инсулин человека 99% чистоты.
В Великобритании с помощью Е. coli синтезированы обе цепи человеческого инсулина, которые затем были соединены в молекулу биологически активного гормона. Чтобы одноклеточный организм мог синтезировать на своих рибосомах молекулы инсулина,![](4432_html_19111440.jpg)
необходимо снабдить его нужной программой, т.е. ввести ему ген гормона. Химическим способом (операцию проводят специалисты биохимики) получают ген, программирующий биосинтез предшественника инсулина или два гена, программирующие в отдельности биосинтез цепей А и В. инсулина. Следующий этап — включение гена- предшественника инсулина (или гены цепей инсулина порознь) в геном Е. coli — особого штамма кишечной палочки, выращенного в лабораторных условиях; эту задачу выполняет генная инженерия. Из Е. coli вычленяют плазмиду соответствующей рестриктазой. Синтетический ген встраивается в плазмиду (клонированием с функционально активной С-концевой частью Р-галактозидазы Е. coli). В результате Е. coli приобретает способность синтезировать белковую цепь, состоящую из галактозидазы и инсулина. Синтезированные полипептиды отщепляют от фермента химическим путём, затем проводят их очистку. В бактериях синтезируется около 100000 молекул инсулина на бактериальную клетку.
Природа гормонального вещества, продуцируемого Е. coli, обусловлена тем, какой ген встраивается в геном одноклеточного организма. Если клонирован ген предшественника инсулина, бактерия синтезирует предшественник инсулина, который подвергается затем обработке рестриктазами для отщепления препептида с вычленением С-пептида, вследствие чего получается биологически активный инсулин. Для получения очищенного инсулина человека выделенный из биомассы гибридный белок подвергают химико-ферментативной трансформации и соответствующей хроматографической очистке (фронтальной, гель-проникающей, анионообменной).
В Институте биоорганической химии РАН получен рекомбинантный инсулин с использованием генно-инженерных штаммов Е. coli. Из выращенной биомассы выделяется предшественник, гибридный белок, экспрессируемый в количестве 40% от всего клеточного белка, содержащий препроинсулин. Превращение его в инсулин in vitro осуществляется в той же последовательности, что и in vivo - отщепляется лидирующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолйза с последующим восстановительным замыканием трёх дисульфидных связей и ферментативным вычленением связывающего Спептида. После ряда хроматографических очисток, включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ, получают человеческий инсулин высокой чистоты и природной активности.
Использование аффинной хроматографии значительно снизило содержание в препарате загрязняющих белков с более высокой м.м., чем у инсулина. К таким белкам относятся проинсулин и частично расщепленные проинсулины, которые способны индуцировать выработку антиинсулиновых антител. Стандартизация инсулина по загрязнению классифицирует препараты на обычные, содержащие проинсулина более 1 %, монопиковые — менее 0,3% п, улучшенные монопиковые — менее 0,005% и монокомпонентные, содержащие менее 0,001% проинсулина.
Использование человеческого инсулина с самого начала терапии сводит к минимуму возникновение аллергических реакций, Наиболее частые осложнения инсулиновой терапии -гипогликемические состояния, основными признаками избытка инсулина являютсянарушения функции ЦНС (спутанность сознания, странное поведение, кома).
Компания «Eli Lilly» в массовом производстве человеческого инсулина использует технологию рекомбинантных ДНК, помещая кДНК гена человеческого проинсулина в Е. coli или S. serevisae и гидролизуя наработанный проинсулин до молекулы инсулина. Человеческий инсулин быстрее абсорбируется и независимо от формы препарата имеет более короткую длительность действия, чем животные инсулины. Человеческие инсулины менее иммуногениы, чем свиные, особенно смешанные бычьи и свиные инсулины.
Контроль качества генноинженерного инсулина предполагает контроль дополнительных показателей, характеризующих стабильность рекомбинантного штамма и плазмиды, отсутствие постороннего генетического материала в препарате, идентичность экспрессируемого гена и др. (всего 22 показателя).
В настоящее время в медицинской практике используют инсулины трех типов:
короткодействующие с быстрым началом эффекта; средней продолжительности действия; длительного действия с медленным проявлением эффекта. Инсулин короткого действия — регулярный инсулин — представляет собой короткодействующий растворимый при нейтральном значении рН кристаллический цинк-инсулин, эффект которого развивается в течение 15 мин после подкожного введения и продолжается 5—7 ч.
С целью увеличения длительности действия все другие препараты инсулина модифицированы и при растворении в нейтральной среде образуют суспензию. Они содержат протамин в фосфатном буфере - протамин-цинк-инсулин и НПХ (нейтральный протамин Хагедорна) -НПХ-инсулин или различные концентрации цинка в ацетатном буфере -инсулины ультраленте, ленте, семженте. Изменяя порядок смешивания и длительность перемешивания, можно осадить две физические фракции цинк-инсулина: аморфную и кристаллическую.
Препараты инсулина средней длительности действия содержат протамин, представляющий белок средней м.м. 4400. богатый аргинином и получаемый из молок радужной форели. Для образования комплекса требуется соотношение протамина и инсулина 1:10. После подкожного введения протеолитические ферменты разрушают протамин. позволяя инсулину всасываться.
НПХ-инсулин не изменяет фармакокинетический профиль смешиваемого с ним регулярного инсулина. НПХ-инсулин предпочтительнее инсулина ленте в качестве компонента средней длительности действия в терапевтических смесях, содержащих регулярный инсулин.
В фосфатном буфере все инсулины (свиной, бычий, человеческий) легко образуют кристаллы с цинком.
Сырьем для получения инсулина из животного сырья является поджелудочная железа рогатого скота и свиней.
Основные стадии:
]. Очистка сырьяпри значении рН 6,5 перемешивают 2 ч; при значении рН 6.2 и 6.0 перемешивают 2 ч и отстаивают 18—20 ч и при значении рН 5,8 перемешивают 2 ч и отстаивают 48—96 ч при температуре 5 °С. Выпавшие кристаллы инсулина отделяют центрифугированием, промывают на воронке Бюхнера ледяной водой дистиллированной, ацетоном и эфиром. Досушивают инсулин на воздухе, в вытяжном шкафу и эксикаторе.
Активность инсулина определяют биологическим путем: по способности понижать содержание сахара в крови у здоровых кроликов. За единицу действия принимают активность 0,04082 мг кристаллического инсулина (стандарта), она должна быть 24—26 ЕД в 1 мг.
Ионно-обменная хроматография основана на различии в кислотно-основных свойствах белков
Адсорбционная хроматография основа на различии в сродстве белков к неполярному адсорбенту
Гель-хроматография основана на различии в молекулярной массе белков
Аффинная хроматография основана на специфичности связывания белков с лигандами
Электрофорез основан на различии в знаке и величине заряда белков.
Вопрос 2. Carbutamide — карбутамид (Букарбан)
![](4432_html_137c4ad6.jpg)
Ы-(п-аминобензолсульфонил)-Н-бутилмочевина
Белый кристаллический порошок, практически нерастворим в воде, растворим в этаноле. Ввиду наличия в молекулах сульфамидной группы, растворы в этаноле и диметилформамиде проявляют кислотные свойства. Растворим в растворах щелочей.
Подлинность производных сульфонилмочевины можно установить методом спектрофотометрии в УФ-области по расположению максимумов поглощения и по удельному показателю поглощения. Раствор карбутамида в этаноле имеет максимум при 269 нм, в 0,1 М растворе хлороводородной кислоты — при 266 и 272 нм, а в 0,1 М растворе гидроксида натрия — при 255 нм.
ПОДЛИННОСТЬ производных сульфонилмочевины устанавливают также с помощью химических реакций.
При нагревании карбутамида в растворе гидроксида калия происходит гидролиз с образованием аммиака, который можно обнаружить по запаху или по изменению окраски лакмусовой бумаги:
![](4432_html_3444e5b5.jpg)
Реакция гидролиза происходит также при кипячении производных сульфонилмочевины с разбавленной серной кислотой. Последующее добавление 30%-пого раствора гидроксида2. Измельчение
3. Экстрагирование
4. Очистка вытяжки от белкрв
5. Очистка от жиров
6. Стандартизация
7. Получение лек.формы
Свежие или замороженные ткани железы измельчают на мясорубке-волчке и экстрагируют способом бисмацерации в эмалированном реакторе с мешалкой. В качестве экстрагента для первой мацерации используют 80—85 % этанол, для второй — 57 % этанол, подкисленный кислотой ортофосфорной (серной, хлороводородной) до значения рН 2,8— 3,0. Экстракцию проводят 1.5—4 ч при перемешивании. Экстракты отделяют фильтрованием или центрифугированием, объединяют и проводят очистку.
Предварительная, грубая очистка экстракта одинакова по всем технологиям, она сводится к удалению анионов кислот. Так, анион кислоты ортофосфорной (РОГ3) удаляют раствором кальция хлорида при значении рН 3,3—-3,8. Затем осуществляют депротеинизацию — последовательное отделение балластных белковых веществ при значении рН 4,5—5,1 и 3,5 при температуре 0 °С. Выпадающие осадки отделяют центрифугированием. Прозрачный экстракт концентрируют выпариванием на вакуум-дистилляционной установке пленочного типа при температуре не выше 30 °С до содержания этанола 10—25% в возможно более короткий срок, при строгом соблюдении температурного режима, так как длительное нагревание приводит к инактивации инсулина. Концентрированный остаток очищают от липидов и балластных белков отстаиванием на холоду (0—4 °С) при значении рН 3,0—3,3. От всплывшего слоя липидов и осадка балластных белков экстракт отделяют фильтрованием. Из сгущенного, очищенного экстракта инсулин-сырец выделяют двукратным высаливанием 25 % раствором натрия хлорида или 40 % раствором аммония сульфата. Этот способ используется на некоторых заводах с 1928 г. по настоящее время.
Наиболее прогрессивным является способ выделения инсулина ионообменной хроматографией. По этому способу операцию упаривания исключают, а осуществляют сорбцию Для удаления жира катионит промывают 65—67 % этанолом, а для отделения балластных белков —- 0,3 М раствором ацетатного буфера (рН 5,3). Десорбцию инсулина проводят 0.01—0,05 М раствором аммонийного буфера (рН 9,8—10,0). Инсулин неустойчив в щелочной среде, поэтому десорбируют его быстро, элюат немедленно подкисляют кислотой хлороводородной до значения рН 4,1—4Г5 и добавляют ацетон. Осадок балластных веществ удаляют. Инсулин осаждают в виде цинк-инсулина раствором цинка ацетата (рН 6,1—6,2), очищают кристаллизацией. Цинк-инсулин растворяют в воде, подкисленной кислотой лимонной до значения рН 2,6—2,8. Раствор отстаивают в течение 1 ч и выпавший осадок балластных белков удаляют фильтрованием через кизельгур. Фильтрат смешивают с ацетоном, добавляют цинк хлористый и фенол, охлаждают до температуры 0 °С, создавая условия для медленной кристаллизации инсулина. Раствор подщелачивают до значения рН 8,0—8,5; оставляют на 2—3 мин, затем создают значение рН 6,7—6,8 н перемешивают 1 ч;натрия приводит к выделению жирных капель аминов, имеющих характерный запах. После более продолжительного нагревания (10-30 мин) в присутствии 50%-ной серной кислоты (с обратным холодильником), последующего охлаждения и нейтрализации выделяется осадок сульфамида.
![](4432_html_mfb559b0.jpg)
Наличие серы устанавливают после спекания со смесью карбоната и нитрата калия. Затем плав растворяют в хлороводородной кислоте и в фильтрате открывают сульфат-ион.
![](4432_html_1e7180b3.jpg)
Сульфамидную группу в глибенкламиде обнаруживают по образованию комплексного соединения с ионом меди (II), выпадающего в виде осадка зеленовато-голубого цвета.
![](4432_html_m4a61bfbb.jpg)
Карбутамид дает ряд других реакций, подтверждающих его подлинность. При пиролизе его кристаллов выделяется аммиак, а плав приобретает фиолетово-красный цвет. После обработки плава этанолом раствор окрашивается в красновато-фиолетовый цвет. При нагревании кристаллов карбутамида и резорцина с 1 мл серной кислоты смесь окрашивается в темно-красный цвет, после разбавления водой и добавления щелочи появляется желто-зеленая флуоресценция.
Карбутамид отличается от других производных сульфонилмочевины наличием первичной ароматической аминогруппы в молекуле.
Реакцию диазотирования и азосочетания с в-нафтолом в щелочной среде. Появляется красное окрашивание.
![](4432_html_m3faecd6b.jpg)
Реакция образования оснований Шиффа.
![](4432_html_m11924c2c.jpg)
Количественное определение карбутамида выполняют по первичной ароматическойаминогруппе нитритометрическиы методом, устанавливая точку эквивалентности с помощью потенциометра, внешнего или внутренних индикаторов.
![](4432_html_m90da344.jpg)
Хранят букарбан в сухом, защищенном от света месте, при температуре до 25 °С во избежании процессов гидролиза, окисления препарата. Список Б.
Производные сульфонилмочевины стимулируют образование инсулина в-клетками поджелудочной железы, понижая при этом содержание сахара в крови. Назначают при различных формах сахарного диабета в виде таблеток; карбутамид по 0,5 г, 43.13.
Вопрос 3. Rhizomata et radices Inulae (Rhizomata et radices Inulae
helenii) — корневища и корни девясила (Inulae rhizoma et radix — девясила корневище и корень)
Дикорастущего многолетнего травянистого растения девясила высокого (lnulahelenium ' L.) из сем. сложноцветных —Asteraceae( Compoitae); используют в качестве лекарственного средства и лекарственного сырья.
Девясил высокий — крупное растение высотой 60-350 см. Корневище толстое, короткое, многоглавое, корни до 20 см длиной и 2-3 см толщиной. Листья продолговато-эллиптические, неравнозубчатые, снизу густоопушенные, бархатистые. Цветки желтые, краевые — ложноязычковые и срединные — трубчатые, собраны в крупные корзинки 6-7 см в диаметре. Плод — четырехгранная бурая семянка с хохолком. Цветет в июле — августе, плоды созревают в августе — сентябре.
Химический состав. Корневища и корни девясила содержат 1-3 % эфирного масла, основными компонентами которого являются сапонины и бициклические сесквитерпеновые лактоны с преобладанием алантолактона и изоалантолактона. Богаты инулином (до 40 %)г*
![](4432_html_4c13ade6.jpg)
Химические методы определения подлинности. Качественные реакции. При нанесении на поперечный срез корневища 2—3 капель раствора йода не должно наблюдаться синего окрашивания (крахмал).
При нанесении на поперечный срез 2—3 капель 20 % спиртового раствора а-нафтола или тимола и 1 капли концентрированной серной кислоты должно наблюдаться красно-фиолетовое или оранжево-красное окрашивание соответственно (инулин).
Заготовка сырья, первичная обработка и сушка. Сырье от дикорастущих растений заготавливают вручную, выкапывая лопатами. Для возобновления зарослей оставляют один вполне развитый плодоносящий экземпляр на 10 м2. Повторные заготовки на этой же заросли возможны через 8 лет. Для восстановления зарослей несколько кусочков корневища, на верхушках которых имеются почки возобновления, закапывают в почву, не заглубляя их.
Выкопанное сырье отряхивают от почвы, быстро промывают в холодной воде, удаляют остатки стеблей (срезая их при основании), а также тонкие корешки и почерневшие или поврежденные корни. Корневища и толстые корни разрезают на куски длиной 3-20 см и расщепляют продольно с толщиной слоя 1-3 см.
Корневища и корни провяливают в течение 2-3 дней на открытом воздухе, а в сырую погоду — под навесом. Затем сушат в теплых, хорошо проветриваемых помещениях или в сушилках при температуре не выше 40 °С. В сухую погоду допускается сушка на солнце.
Хранение. На складах сырье хранят отдельно от других видов сырья. Срок годности сырья 3 года.
Использование. Корневища и корни девясила в аптеки поступают в измельченном виде и в форме брикета. Отвар из сырья девясила применяют как отхаркивающее средство при заболеваниях верхних дыхательных путей. Они также входят в состав противокашлевых сборов; используются для получения представляющего собой сумму сесквитерпеновых лактонов препарата «Алантон», который обладает противовоспалительным действием; применяют при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки.
Используется в гомеопатии как маточное средство. Пряность.
Вопрос 4. Рецепт выписан верно. Срок действия рецепта - 2 мес. Рецепт отдается больному с указание на обороте количества отпущенного препарата и даты отпуска и не хранится в аптеке. По истечении срока действия рецепт гасится штампом «Рецепт не действителен».
Способ применения ЛС обозначается на русском или русском и национальном языках с указанием дозы, частоты, времени приема и его длительности, а для ЛС,
В защите от действия пониженной температуры нуждаются растворы инсулина. Препараты инсулина разрушаются при замерзании.
Хранят при Т от +2 до +8С
Сроки годности см билет №24Билет 32. Вопрос 1.
Пенициллины
Структурной основой лекарственных веществ полусинтетических пенициллинов является 6-аминопенициллановая кислота, которая включает конденсированные тиазолидиновый (А) и лактамный (В) циклы:
![](4432_html_2fb85b96.jpg)
Лактамный цикл впервые обнаружен в природных пенициллинах и отличается большой лабильностью к воздействию различных факторов.
Пенициллин получают путем микробиологического синтеза. Процесс биосинтеза пенициллинов происходит в асептических условиях при непрерывной аэрации воздухом, температуре около 24°С, рН 6,0-6,5 и должен сопровождаться постоянным перемешиванием. Наличие жира в питательной среде оказывает пеногасящее действие и одновременно стимулирует процесс биосинтеза пенициллинов.
Выделение пенициллина из культуральной жидкости осуществляют фильтрованием или центрифугированием. Вначале мицелий и нерастворимые минеральные соли отделяют от культуральной жидкости. Очистку культуральной жидкости и выделение из нее пенициллина последовательно проводят способом замены растворителя
Отделяют пенициллины друг от друга различными способами: адсорбционной хроматографией (на активированном угле или оксиде алюминия); распределительной хроматографией (на. силикагеле) или противоточным распределением. Воду из растворов удаляют при температуре от -20 до -30°С и глубоком вакууме (лиофильная сушка) или пользуясь распылительной сушилкой, что позволяет предотвратить разложение. Кристаллические соли высокой степени чистоты получают перекристаллизацией из органических растворителей.
Ацилирование 6-АПК (6-аминопенициллановой кислоты) хлор ангидридам и кислот можно получить полусинтетические пенициллины (ампициллин)
Биологические свойства полусинтетических пенициллинов зависят от характера заместителя в положении 6. Устойчивость к b-лактамазам обеспечивают заместители, создающие стерические препятствия разрыву b-лактамного цикла. Поэтому синтетические пенициллины с аминогруппой и карбоксилом в боковой цепи (в положении 6), как правило, обладают более широким спектром антибактериального действия, чем природные пенициллины. В результате разработаны и внедрены в производство такие полусинтетические пенициллины, как ампициллин.
[ Лекарственное вещество Химическая структура Описание
1 СП![](4432_html_16cf5a5e.jpg)
|
|
|