методичка. Розділ 1. Методичні вказівки для підготовки до практичних занять. Методичні вказівки для підготовки до практичних занять

• Название: Методичні вказівки для підготовки до практичних занять
• Анкор: методичка
• Дата: 21.10.2022
• Размер: 0.7 Mb.
• Имя файла: Розділ 1. Методичні вказівки для підготовки до практичних занять.doc
• Тип: Методичні вказівки; #745722
• страница: 6 из 11

Оформлення роботи: заповнити таблицю.

Практичне значення роботи. Ферменти, що мають абсолютну субстратну специфічність, використовуються в клініці як аналітичні реагенти для визначення речовин, що є їх субстратами. Наприклад, уреаза використовується для визначення сечовини в біологічному матеріалі та лікарських препаратах; глюкозоксидаза – для визначення кількості глюкози в крові та сечі. Ферменти з абсолютною та відносною груповою субстратною специфічністю мають меншу вибірковість дії на субстрати, беруть участь, як правило, у гідролізі поживних речовин або в перетворенні чужорідних сполук. Наприклад, α-амілаза і сахараза проявляють специфічність не до структури субстрату в цілому, а до типу глікозидних зв’язків, що мають місце у відповідних вуглеводах.

ТЕМА 4 (2 години): Регуляція ферментативних процесів. Інгібітори та активатори ферментів. Медична ензимологія. Кількісне визначення активності α-амілази та лактатдегідрогенази у сироватці крові.

АКТУАЛЬНІСТЬ. Досягнення ензимології (науки про ферменти) широко впроваджуються в медицину. Розвиток медичної ензимології відбувається у трьох головних напрямках: ензимопатологія, ензимодіагностика та ензимотерапія, що дозволяє вирішувати проблеми патогенезу ензимопатій, застосовувати ферментні тести для діагностики органічних і функціональних розладів органів та тканин, а також використовувати ферменти і модулятори їхньої дії як лікарські засоби. Так, підвищення активності лужної фосфатази у сироватці крові спостерігається при рахиті, пухлинах кісткової тканини, гіперпаратиреозі, механічній жовтяниці, вірусному гепатиті, а зниження - при гіпотиреозі, гіповітамінозі С та ін. Активність лактатдегідрогенази у крові підвищується при інфаркті міокарда, пошкодженнях скелетних м’язів, нирок, а також при анеміях, пухлинах, гострому гепатиті. Ферменти - пепсин, трипсін, гіалуронідаза та інші - використовуються як лікувальні препарати, а також у клініко-біохімічних лабораторіях як аналітичні реактиви (глюкозооксидаза, уреаза та ін.).

МЕТА. Вивчити та вміти аналізувати механізми регуляції ферментативних процесів як основи обміну речовин в організмі в нормі та при патології; зміни перебігу ферментативних процесів та накопичення проміжних продуктів метаболізму при спадкових та набутих вадах метаболізму – ензимопатіях; зміни активності індикаторних ферментів плазми крові при патології певних органів та тканин; застосування ферментів та їх модуляторів як фармакологічних препаратів при певних патологічних станах. Ознайомитися з методами кількісного визначення активності α-амілази і лактатдегідрогенази у сироватці крові та їх клініко-діагностичним значенням.

ТЕОРЕТИЧНІ ПИТАННЯ

1.	Регуляція ферментативних процесів. Шляхи та механізми ре­­­гуляції: алостеричні взаємодії у ферментах; ковалентна модифікація фер-ментів; дія регуляторних білків-ефекторів (кальмодуліну, протеїназ, про­­­теїназних інгібіторів). Циклічні нуклеотиди як регулятори фер­­­ментативних реакцій та біологічних функцій клітини.
2.	Інгібітори та активатори ферментів. Типи інгібування ферментів: оборотне (конкурентне, неконкурентне, безконкурентне) і необоротне. Приклади.
3.	Основні аспекти сучасної ензимодіагностики. Індикаторні, секреторні та екскреторні ферменти. Ізоферменти в ензимодіагностиці, тканинна специфічність розподілу ізоферментів. Зміни активності ферментів плазми та сироватки крові як діагностичні показники розвитку патологічних процесів в органах і тканинах.
*4.	Застосування ензимодіагностики в кардіології, урології, онкології тощо.
*5.	Порушення перебігу ферментативних процесів: спадкові та набуті ензимопатії, природжені вади метаболізму, їх клініко-лабораторна діагностика.
*6.	Ензимотерапія – використання ферментів як лікарських засобів. Фармакологічне застосування ферментів шлунково-кишкового тракту, згортальної та фібринолітичної систем крові, калікреїн-кінінової та ренін-ангіотензинової систем. Інгібітори ферментів як лікарські засоби.

Орієнтувальна картка для опрацювання теоретичних питань

для самостійного вивчення

Зміст	Вказівки до навчальних дій
1. Ензимодіагностика – постановка діагнозу на основі визначення активності ферментів у біологічних рідинах організму.	1.1. Принципи ензимодіагностики: органоспецифічність ензимів; підвищення активності органоспецифічних ензимів у крові в результаті пошкодження клітинних мембран; достатня кількість ензиму для визначення в крові. 1.2. Ензимодіагностика в кардіології: визначення активності в крові МВ-ізоформи КФК; ЛДГ1,2; АсАТ та ін. 1.3. Ензимодіагностика в урології: визначення активності в крові гліцинамідинтрансферази, урокінази, арилсульфатази, АлАТ, АсАТ, ЛДГ, альдолази, малатдегідрогенази (МДГ), глутамінсинтетази, лужної фосфатази та ін. 1.4. Ензимодіагностика в онкології: визначення активності в крові ферментів катаболізму вуглеводів, анаболізму білків та нуклеїнових кислот (зокрема, гексокінази, піруваткінази, ЛДГ, МДГ та ін.).
2. Ензимопатії – патологічні стани, пов’язані з дефектом ензимів.	2.1. Первинні (спадкові) та вторинні (набуті) ензимопатії. Причини виникнення. 2.2. Належність до ензимопатій природжених порушень метаболізму: простих і складних вуглеводів (галактоземія, фруктоземія, глікогенози, мукополісахаридози та ін.); ліпідів (сфінголіпідози: хвороба Гоше, Тея-Сакса, Німана-Піка та ін.); амінокислот (фенілкетонурія, алкаптонурія, тирозиноз, альбінізм, гіперамоніємія, цистиноз, лейциноз та ін.); порфіринів (порфірії); пуринів та піримідинів (синдром Леша-Ніхана, ксантинурія, оротацидурія).
3. Ензимотерапія - використання ферментів як лікарських засобів.	3.1. Замісна терапія – нормалізація процесів травлення: - пепсин, фестал, трипсин, мезим та інші (при дефіциті ферментів ШКТ, що виникає у зв’язку з недостатньою активністю ферментів, зокрема при запальних процесах шлунка та кишечнику); - креон, панкреатин, панзинорм (при порушеннях функції підшлункової залози, зокрема, при панкреатиті, муковісцидозі). 3.2. Протипухлинна дія: аспарагіназа – антилейкемічна дія, гідролізує аспарагін, необхідний лейкозним клітинам для їх розвитку. 3.3. Поліпшення процесів тканинного дихання: - цитохром с – при асфіксії новонароджених, бронхіальній астмі, хронічній пневмонії, іше-мічній хворобі серця, гепатиті. 3.4. Фібринолітичні засоби: фібринолізин (плазмін), урокіназа, стрептокіназа – при лікуванні гострого інфаркту міокарда. 3.5. Первинна обробка ран, опіків: трипсин, хімотрипсин. 3.6. Лікування вірусних захворювань: нуклеази (ДНК-аза, РНК-аза) – при вірусних кон’юнкти-вітах. 3.7. Використання коферментів: ТДФ – кокарбоксилаза – в терапії серцево-судинних захворювань. 3.8. Використання інгібіторів ферментів: при передозуванні тромболітиків (фібринолізину, стрептокінази) - трасилол, контрикал, амінокапронова кислота (інгібітори протеолізу); при механічних, термічних та хімічних травмах, тромбозах; в онкології – пригнічення активності ферментів пухлинних клітин; при артеріальній гіпертензії – інгібітор ангіотензинперетворюючого ферменту (еналаприл, каптоприл, лізиноприл).

ТЕСТОВІ ЗАВДАННЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЮ

1. Для лікування хворого було використано протизапальний засіб, що блокує дію циклооксигеназ. Таким протизапальним засобом є:

A. Пепсин B. Алопуринол C. Тіамін D. Аспірин E. Анальгін

2. Протеолітичні ферменти шлунка і підшлункової залози синтезуються в неактивній формі - у вигляді зімогенів, а потім активуються в ШКТ. Назвіть протеолітичний фермент шлунка, що виділяється в неактивному стані.

A. Трипсин B. Хімотрипсин C. Пепсин

D. Еластаза E. Колагеназа

3. Для попередження нападів гострого панкреатиту лікар призначив трасилол (контрикал, гордокс), який є інгібітором:

A. Трипсину B. Хімотрипсину C. Гастриксину

D. Карбоксипептидази E. Еластази

4. У хворого на гострий панкреатит у крові та сечі різко підвищена активність ферменту:

A. Пепсину B. -Амілази C. Дипептидази

D. Сахарази E. Лактази

5. Назвіть фермент, визначення вмісту якого у крові є найбільш інформативним у перші години після інфаркту міокарда.

A. Аспартатамінотрансфераза B. Аланінамінотрансфераза

C. Лактатдегідрогеназа D. Глутаматдегідрогеназа

E. Креатинфосфокіназа

6. Виділяють декілька груп молекулярних механізмів, які відіграють важливу роль у патогенезі пошкодження клітин, що сприяє розвитку патології. Які процеси забезпечують протеїнові механізми пошкодження?

A. Пригнічення ферментів B. Перекисне окиснення ліпідів

C. Активація фосфоліпази D. Осмотичне розтягнення мембран
E. Ацидоз

7. Фосфорорганічні сполуки (високотоксичні отрути нервово-паралітичної дії) гальмують ацетилхолінестеразу шляхом утворення ковалентних зв'язків з ОН-групами серину в активному центрі ферменту. Який тип інгібування характерний для цього класу сполук?

A. Оборотне B. Конкурентне C. Неконкурентне

D. Необоротне E. Ретроінгібування

8. Назвіть тип інгібування, при якому інгібітор приєднується ні до ак-тивного центру ферменту, а до іншої специфічної ділянки молекули.

A. Алостеричне B. Неконкурентне C. Безконкурентне

D. Субстратне E. Конкурентне

9. Ензимотерапія - напрям медичної ензимології, пов'язаний із застосуванням ферментів для лікування різних захворювань. Назвіть фермент, який застосовується у комплексній терапії з метою усунення набряків, гематом, келоїдних рубців.

A. Карбоксипептидаза B. Колагеназа C. Пепсин

D. Амілаза E. Ліпаза

10. До відділення інтенсивної терапії доставлена жінка з діагнозом - інфаркт міокарда. Активність якого ферменту буде підвищеною протягом перших двох діб?

A. Аланінамінотрансферази B. γ- Глутамілтранспептидази

C. Аспартатамінотрансферази D. ЛДГ₄ E. ЛДГ₅

11. У хворого - гострий панкреатит. Які препарати повинен призначити лікар, щоб уникнути аутолізу підшлункової залози?

A. Активатори протеаз B. Трипсин C. Хімотрипсин

D. Амілазу E. Інгібітори протеаз

12. Одним із шляхів регуляції активності ацетил-КоА-карбоксилази (лімітуючого ферменту в синтезі жирних кислот) є ретроінгібування кінцевим продуктом - пальмітоїл-КоА. Ретроінгібування є варіантом:

A. Ковалентної модифікації ферменту B. Конкурентного інгібування

C. Необоротного інгібування D. Алостеричного інгібування

E. Неконкурентного інгібування

13. У пацієнта прогресуюча м'язова дистрофія. Який з нижче перелічених біохімічних показників має діагностичне значення у цьому випадку?

A. Креатинфосфокіназа B. Піруватдегідрогеназа

C. Лактатдегідрогеназа D. Глутаматдегідрогеназа E. Аденілатциклаза

14. Активність яких ферментів слід визначати з діагностичною і прогностичною метою, якщо до клініки поступив хворий з патологією серцевого м’яза?

A. Лізоциму, цитратсинтази, альдолази

B. Нейрамінідази, гексокінази, піруваткінази

C. Малатдегідрогенази, піруватдегідрогенази, сукцинатдегідрогенази

D. Креатинкінази, аланін- і аспартатамінотрансферази

E. Аргінази, пептидази, фосфатази

15. Назвіть тип інгібування, при якому хімічну будову інгібітора нагадує будову субстрату.

A. Неконкурентне B. Конкурентне C. Безконкурентне

D. Субстратне E. Необоротне

16. Табун, зарин, диізопропілфторфосфат (фосфорорганічні сполуки) є отрутами нервово-паралітичної дії. Який з перелічених ферментів інгібується фосфорорганічними сполуками?

A. Фосфоліпаза А₂ B. Ацетилхолінестераза C. Цитохром Р-450

D. Ангіотензин-перетворюючий фермент

E. Тирозинамінотрансфераза

17. Ферменти широко використовуються як лікарські препарати. Який з наведених ферментів використовується для лікування лейкозів?

A. Аспарагіназа B. Дегідрооротаза C. Енолаза

D. Фумараза E. Каталаза

18. Ензимотерапія - напрям медичної ензимології, пов'язаний із застосуванням ферментів для лікування різних захворювань. Назвіть фермент, який застосовується при лікуванні інфаркту міокарда.

A. Фосфофруктокіназа B. Піруваткіназа C. Стрептокіназа

D. Гексокіназа E. Фосфогліцерокіназа

19. При аналізі шлункового соку хворого з діагнозом гіпоацидний гастрит виявлено значне зниження активності пепсину. Укажіть можливий біохімічний механізм цього явища.

A. Денатурація молекули ферменту

B. Конкурентне інгібування ферменту

C. Зниження енергії активації ферментативної реакції

D. Відсутність внутрішнього фактора Касла в шлунковому соку

E. Порушення утворення ферменту з проферменту

20. Укажіть активатор амілази слини.

А. Хлорид натрію В. Сульфат амонію С. Сульфат міді

D. Хлорид магнію Е. Глюконат кальцію

21. Укажіть тип інгібування, при якому інгібітором ферменту є продукт реакції: А. Конкурентне В. Неконкурентне С. Безконкурентне

D. Стереохімічне Е. Ретроінгібування

22. Укажіть фермент, активність якого визначається у плазмі крові па-цієнтів з патологією кісткової тканини:

А. Пепсин В. Трипсин С. Амілаза

D. Кисла фосфатаза Е. Лужна фосфатаза

23. Який механізм інгібування синтезу фолієвої кислоти сульфаніламідними препаратами?

А. КонкурентнийВ. Необоротний С. Денатурація ферменту

D. НеконкурентнийЕ. Зв’язування з алостеричними центрами ферментів

ПРАКТИЧНА РОБОТА

Кількісне визначення активності α-амілази у сироватці крові

методом Каравея

Завдання 1. Визначити активність α-амілази у сироватці крові методом Каравея.

Принцип методу. α-Амілаза (α-1,4-глюкан-4-глюканогідролаза; КФ 3.2.1.1.) каталізує гідролітичне розщеплення крохмалю з утворенням кін-цевих продуктів, які не дають забарвлення з йодом. Про активність фер-менту судять за надлишком крохмалю, який визначають за зміною забарв-лення йодо-крохмального розчину спектрофотометричним методом.

Реактиви: 1) Субстратно-буферний розчин (рН 7,0): 26,6 г натрію гідрогенфосфату; 8,6 г бензоатної кислоти розчиняють у 500 мл дистильованої води, доводять до кипіння. 0,4 г крохмалю розчиняють у невеликій кількості дистильованої води і вливають у киплячий розчин. Кип’ятять протягом 1 хвилини, після охолодження доводять об'єм дистильованою водою до 1 літра. 2) Основний розчин йоду – 0,1 ммоль/л: 3,567 г калію йодату і 45 г калію йодиду. Калію йодид розчиняють у 800 мл дистильованої води, додають 9 мл концентрованої хлоридної кислоти та доводять об’єм до 1 літра дистильованою водою. 3) Робочий розчин йоду – 0,01 ммоль/л: 50 г феруму йодиду, 100 мл основного розчину йоду; доводять об’єм до 1 літра дистильованою водою.

Хід роботи. Визначення активності α-амілази у сироватці крові провести за наступною схемою:

Хімічний посуд	Об’єм піпетки, мл	Реактиви	Проба, мл	Контроль, мл	Етапи
Хімічні пробірки	1	субстратно-буферний розчин	1	1	перед- інкубація
	інкубувати 5 хвилин при температурі 37°С
	0,1	сироватка крові	0,02	-
	змішати, інкубувати протягом 7,5 хвилин при температурі 37°С (ферментативна реакція)
	1	Робочий розчин йоду	1	1	кольорова реакція
	0,1	сироватка крові	-	0,02
		дистильована вода	до 10	до 10
	змішати, виміряти Епр і Ек при довжині хвилі 630-690 нм у кюветі (10 мм) проти дистильованої води протягом 5 хвилин (фотометрія)

Активність α-амілази у сироватці крові розраховують за формулою:

Ек – Епр

активність α-амілази г/л∙год = -------------- ∙ 160 ∙ К, де

Ек

Ек – екстинкція контролю; Епр – екстинкція проби; 160 – коефіцієнт розрахунку, який враховує кількість крохмалю, введеного в пробу і контроль, на 1 л біологічної рідини за годину інкубації при температурі 37°С; К – коефіцієнт розбавлення досліджуваної сироватки крові.

Клініко-діагностичне значення роботи. У нормі активність α-амілази у сироватці крові становить 12-32 г/л∙год.Підвищення активності у крові та сечі спостерігають при захворюваннях підшлункової залози. При гострому панкреатиті активність α-амілази підвищується в 10-30 разів, максимальну активність виявляють у першу добу хвороби, а потім вона швидко нормалізується на 2-6 добу. Гіперамілаземію спостерігають при гострому апендициті, перфоративній виразці шлунка та дванадцятипалої кишки, холециститі, розриві жовчного міхура, опіках, травматичному шоку, пневмонії, простатиті, уремії. Підвищенню активності α-амілази сприяють лікарські препарати (кортикостероїди, катехоламіни, фуросемід, антикоагулянти), наркотики, алкоголь. Зниження активності α-амілази спостерігають при гепатиті, цирозі, злоякісних утвореннях печінки, цукровому діабеті, гіпотиреозі, кахексії.

Кількісне визначення активності лактатдегідрогенази (КФ 1.1.1.27)

у сироватці крові за Севелом і Товареком

Завдання 1. Визначити активність лактатдегідрогенази у сироватці крові за Савелом і Товареком.

Принцип методу. Під впливом ЛДГ L-лактат за наявності нікотинамідаденіндинуклеотиду (НАД) окислюється до пірувату. Кількість утвореного пірувату визначають фотометрично за кольоровою реакцією з 2,4-динітрофенілгідразином, в якої утворюється 2,4-динітрофенілгідразон, що має червоно-буре забарвлення в лужному середовищі, інтенсивність якого прямо пропорційна вмісту кетокислоти.

ЛДГ

СН₃-СН(ОН)-СООН + НАД⁺ → СН₃-СО-СООН + НАДН(Н⁺)

лактат піруват

Хід роботи. В одну пробірку вносять 0,1 мл в 3 рази розведеної сироватки крові; 0,3 мл свіжоприготовленого розчину 0,02 моль/л НАД⁺ і ставлять на 5 хвилин на водяну баню при 37°С для нагрівання суміші. У другу пробірку вносять 0,8 мл розчину 0,03 моль/л натрію пірофосфату, 0,2 мл розчину 0,45 моль/л натрію лактату і нагрівають на водяній бані при 37°С. Виливають вміст другої пробірки в першу, швидко перемішують скляною паличкою, не виймаючи пробірки з бані, і відзначають час початку інкубації. Через 25 хвилин реакцію припиняють додаванням 0,5 мл 0,2% розчину 2,4-динітрофенілгідразину в розчині 1 моль/л хлоридної кислоти і залишають пробірку на 20 хвилин при кімнатній температурі для утворення гідразону. До суміші додають 5 мл розчину 0,4 моль/л натрію гідроксиду, вміст перемішують скляною паличкою і через 10 хвилин вимірюють екстинкцію дослідної проби проти контрольної на ФЕК при довжині хвилі 520-560 нм у кюветах товщиною 10 мм. Контрольну пробу готують як і дослідну, але розведену сироватку додають після інкубації. Активність ферменту розраховують за калібрувальним графіком, умови побудови якого наведені в таблиці.

№ про-бір- ки	Робочий стандарт-ний розчин натрію пірувату, мл	Розчин 0,03 моль/л натрію пірофос-фату, мл	Дист. вода, мл	Вміст пірувату в пробі, мкмоль	Одини- ці актив-ності ЛДГ ммоль/ л∙год	Екс-тинк-ція
1	0,1	0,8	0,5	0,01	1,2
2	0,2	0,8	0,4	0,02	2,4
3	0,4	0,8	0,2	0,04	4,8
4	0,6	0,8	-	0,06	7,2
5	0,8	0,8	-	0,08	9,6

На осі ординат відкладають значення екстинкції, а на осі абсцис – відповідні їм одиниці активності ЛДГ, які виражені в ммоль/л∙год.

Клініко-діагностичне значення роботи. Визначення активності лактатдегідрогенази (ЛДГ) використовується у клініко-біохімічних лабораторіях для діагностики захворювань, а також як тест на одужання. У нормі активність ферменту в сироватці крові становить 0,8-4,0 ммоль/л∙год. Активність ЛДГ підвищується при ушкодженні міокарда, лейкозі, хворобах нирок, гемолітичній та серпоподібноклітинній анемії, тромбоцитопенії, інфекційному мононуклеозі, а також при прогресуючій м’язовій дистрофії. При хворобах, які супроводжуються некрозом тканин (інфаркт міокарда, некротичні ураження нирок, гепатит, панкреатит, пухлини), спостерігають різке підвищення активності ЛДГ у сироватці крові. При гострому гепатиті активність ЛДГ у сироватці крові підвищується в перший тиждень жовтяничного періоду, при легкому та середньому ступені тяжкості хвороби активність ферменту швидко нормалізується. У хворих з гострим інфарктом міокарда спостерігається підвищення активності загальної ЛДГ та ЛДГ₁ у сироватці крові через 8-18 годин після початку нападу, яке досягає максимуму через 24-72 години. Активність ферментів залишається високою протягом першого тижня і нормалізується на 6-10 добу. Також має значення визначення співвідношення ЛДГ₁/ЛДГ₂, яке у нормі становить 0,4-0,74, а при гострому інфаркті міокарда зростає у 5-10 разів. При стенокардії активність ЛДГ у сироватці крові не підвищується.