Гематология. Навчальний посібник для студентів вищих медичних навчальних закладів
 Скачать 4.62 Mb.
|
|
Загальний білок Уніфікований метод визначення загального білка в сироватці крові за біуретовою реакцією. Принцип методу. У лужному середовищі білки реагують з сульфатом міді з утво- Розділ 2. Методи дослідження в гематології 39 ренням сполуки, забарвленої у фіолетовий колір (біуретова реакція). Інтенсивність забарвлення пропорційна концентрації білків. У нормі концентрація загального білка в сироватці крові складає 65-85 гл. Для оцінки вмісту загального білка в сиро- ватці крові, як відзначалося раніше, використовують наступні поняття: нормо-, гіпо-, і гіперпротеїнемія при нормальному, зниженому або підвищеному вмісті білка. Альбумін Визначення концентрації альбуміну (уніфікований метод за реакцією з бромкрезоловим зеленим). Принцип методу. Альбумін здатний взаємодіяти в слабокислому середовищі у присутності детергенту з бромкрезоловим зеленим з утворен- ням сполуки синього кольору. Ступінь інтенсивності забарв- лення розчину пропорційна вмісту альбуміну. Норма 35-50 гл. Білкові фракції Методи розділення білків сироватки крові. До основних методів фракціонування білків сироватки крові можна віднес- ти висолювання нейтральними солями, електрофорез, хрома- тографію, гель-фільтрацію, імунологічне розділення. Визначення білкових фракцій сироватки крові турбі- диметричним методом. Принцип методу ґрунтується на здат- ності фосфатних розчинів певної концентрації осаджувати з утворенням дуже дрібної суспензії різні білкові фракції сиро- ватки крові. За ступенем каламутності розчинів, що встанов- люється за допомогою фотоелектроколориметра, судять про концентрацію білків у досліджуваному матеріалі. Примітка: при додаванні води до зависі основного фосфатного буфера розчин необхідно ретельно розмішувати. При зберіганні розведених розчинів з метою поперед- ження бактерійного забруднення рекомендується до них дода- вати по 1 краплі хлороформу. Гематологія 40 Норма така сама, що і при визначенні білкових фракцій методом електрофорезу. Визначення білкових фракцій сироватки крові методом електрофорезу.Під електрофорезом розуміють рух зарядже- них часток у постійному електричному полі. У разі електро- форезу білків сироватки крові останні, маючи певний заряд, рухаються в електричному полі до анода чи катода залежно від знаку заряду. Заряд білкової молекули, у першу чергу, ви- значається за показником ізоелектричної точки досліджувано- го білка (pI) і значенням рН буфера, з використанням якого робиться розділення. Якщо значення рН>рI, то білок заряджа- ється негативно (-), у разі рН<рI — позитивно (+). Таким чином, у першому випадку білок буде пересуватися до позитивного електрода (анода, у другому — до негативного (катода. У практиці клініко-діагностичних лабораторій найчастіше ви- користовують буферні системи з рН = 8,6, тому білки сироват- ки крові заряджатимуться негативно і при проведенні елект- рофорезу їх слід наносити ближче до катода. Залежно від по- казників молекулярної маси і заряду білки сироватки крові при використанні в якості підтримуючого середовища плівки з ацетату целюлози або агарозних гелів розподіляються на 5 ос- новних фракцій: альбумін, α1 -, α2 -, β- і γ-глобуліни. При проведенні електрофорезу можна виділити 6 основ- них етапів: 1. Підготовка середовища до електрофоретичного роз- ділення. 2. Уміщення середовища в камеру для електрофорезу і забезпечення електричного контакту з буферними кюветами. 3. Нанесення проби. 4. Проведення електрофорезу в заданому режимі напру- ги і сили струму. 5. Фіксація та виявлення отриманих фракцій за допомо- гою відповідних барвників. 6. Кількісна оцінка виявлених фракцій. Електрофоретичне розділення білкових фракцій на плів- ках з ацетату целюлози (уніфікований метод).Уперше плівки з ацетату целюлози в якості підтримуючого середовища для Розділ 2. Методи дослідження в гематології 41 електрофорезу були запропоновані Kohn в 1957 році. Ці плів- ки мають однорідну мікропористу структуру, що нагадує мік- роскопічну губку, з середнім діаметром пір, рівним декільком мікронам. Плівки з ацетату целюлози відрізняються високою чистотою. У них відсутні геміцелюлози і лігніни, а важкі метали зустрічаються лише в дуже малих кількостях. До досто- їнств цього підтримуючого середовища слід віднести дуже низьку адсорбційну здатність, унаслідок чого після проведен- ня електрофорезу практично не утворюються так звані «хвос- ти», що спостерігаються при проведенні електрофорезу на па- пері. Фон після забарвлення і відмивання виходить безбарв- ним, і на ньому чітко виявляються смуги, що розділилися. Ці переваги дозволяють використати електрофорез на плівках з ацетату целюлози для визначення надзвичайно малих кількос- тей речовин, причому на проведення дослідження доводиться витрачати невелику кількість часу. В якості приладів для проведення електрофорезу на плів- ках з ацетату целюлози можуть бути використані апарати, спеціально призначені для цього типу електрофорезу, або прилади, що використовуються для проведення електрофорезу на папері. Нормальні показники. Альбуміни -56-76% α 1 -глобуліни — 2-7% α 2 -глобуліни — 4-12% β-глобуліни — 3-12% γ-глобуліни — 8-18% Розділення білкових фракцій у гелі агарози.Хороші ре- зультати вдається отримати при використанні в якості підтри- муючого середовища гелів агарози. З цією метою доцільно використовувати агарозу з середнім ендоосмосом. Уведення в буферний розчин іонів кальцію дозволяє додатково розділити β-глобулінову фракцію на дві складові: β 1 - і β 2 -глобуліни. β 2 -глобулінова фракція в цьому випадку буде представлена С 3 -компонентом комплементу, що дозволяє оцінити його кон- центрацію безпосередньо на електрофореграмі без викорис- тання додаткових методів дослідження. Для електрофорезу Гематологія 42 можуть бути використані спеціальні апарати або апарати, при- значені для електрофорезу на папері. Полімеризацію агарози можна здійснювати на спеціальних полімерних плівках або на скляних пластинках певного розміру (залежно від розмірів електрофоретичного апарату). Як правило, використовуються 0,8-1% гелі агарози завтовшки 1 мм. Інтерпретація результатів електрофоретичного розді- лення білків сироватки крові.Зона преальбуміну. Білки цієї зони ледве помітні на електрофореграмі і представлені у ви- гляді досить дифузної фракції. Зазвичай їх краще видно на агарозному гелі при розгляді електрофореграми на світлому фоні в умовах розсіяного освітлення. У нормі в цій зоні роз- ташовуються преальбумін і ретинолзв’язуючий білок. Поло- ження преальбуміну на електрофореграмі може варіювати в результаті утворення комплексів і, можливо, генетичного по- ліморфізму. При порушеннях проміжного обміну ліпопротеї- нів дуже низької щільності або вторинному ліполізі в преаль- буміновій зоні можуть знаходитися α-ліпопротеїни. Відомі випадки знаходження в цій фракції альбуміну, який змінює свою електрофоретичну рухливість унаслідок адсорбції де- яких кислих сполук, зокрема лікарських засобів. У цілому рівень преальбуміну сироватки крові може служити раннім критерієм порушення нормальної функції клі- тин печінки. Зона альбуміну. Ця фракція на електрофореграмах є най- більш вираженою та тривалою, що обумовлено перевагою альбуміну над іншими плазмовими білками і його значною гетерогенністю. Остання зумовлена наявністю в альбуміну «анодних» і «катодних» фракцій, які особливо виражені в па- цієнтів з бісальбумінемією. Електрофоретична рухливість альбуміну може значно змінюватися в результаті зв’язування їм екзогенних і ендоген- них заряджених органічних сполук. Найбільш частою причиною збільшення рухливості альбумінової фракції є гіпербілі- рубінемія, адсорбція неестерифікованих жирних кислота та- кож прийом великих доз аспірину. Збільшення рухливості біл- ка спостерігається також після парентерального введення великих доз пеніциліну, продукти розпаду якого здатні зв’язува- Розділ 2. Методи дослідження в гематології 43 тися з альбуміном. Навпаки, електрофоретична рухливість альбуміну знижується внаслідок присутності в досліджуваних зразках іонів деяких важких металів (наприклад, міді). Альбумін-α 1 -проміжна зона. Ця зона зазвичай рівномір- но забарвлена, що обумовлено переважною присутністю гете- рогенних α-ліпопротеїнів. Іноді в цій області може знаходити- ся α-фетопротеїн, а також швидко мігруючий α 1 -антитрипсин. Інтенсивність забарвлення цієї проміжної зони вище в жінок під час статевого дозрівання, а також після введення естрогену і під час вагітності. зона. Основним компонентом цієї фракції є α 1 -антитрипсин. Селективне збільшення α 1 -антитрипсинової фракції відбувається при посиленій продукції естрогену, а її роздвоєння нерідко відзначається при вагітності. α 1 -α 2 -проміжна зона. Між фракціями α 1 - і α 2 -глобулінів може визначатися до 3 забарвлених смуг, які відповідають групоспецифічним компонентам, інтер-α-інгібітору трипсину і білка, що з’являється при вагітності. зона У цій частині електрофореграми зазвичай є при- сутньою суміш білкових компонентів, основними з яких є α 2 -макроглобуліни і гаптоглобіни. У дітей раннього віку, як правило, домінує α 2 -макроглобулін, інші ж α 2 -глобуліни не виявляються. Інтенсивність забарвлення цієї зони може зрос- тати при утворенні гаптоглобін-гемоглобінового комплексу. Для попередження такого посилення забарвлення необхідно стежити, щоб в досліджуваних зразках не було слідів гемолізу. α 2 -β 1 -проміжна зона В основі цієї невеликої зони, що нерідко виявляється на електрофореграмах, лежить холодоне- розчинний глобулін фібробластів (фібронектин). Концентрація цього білка зменшується при зсіданні плазми, оскільки він зв’язується з фібрином. Фібронектин складає основну масу кріопреципітату в обробленій при +С гепарином плазми. Дифузний характер цієї зони і ненормально висока її ру- хливість можуть спостерігатися в разі зниження концентрації пре-β- і β-ліпопротеїнів, особливо після зберігання досліджу- ваних зразків плазми. При забрудненні зразків гемоглобіном останній мігрує в α 2 -β 1 -проміжну зону, накладаючись на чер- гову частину β 1 -смуги. Гематологія 44 зона Інтенсивність забарвлення цієї смуги електрофо- реграми пропорційна концентрації трансферину. При гетеро- генності фракції генетично обумовленими варіантами білка виразно виявляються дві смуги, які мають однакове (наполовину слабкіше за нормальну) забарвлення. При розпаді ком- плементу С його фрагмент мігрує на анодному боці β 1 -смуги. Це є артефактом, обумовленим зберіганням зразків сироватки. Подібний розпад відбувається значно швидше в сироватці, отриманій від хворих із запальними процесами. β 1 -β 2 -проміжна зона. Домінуючим компонентом зони є β-ліпопротеїни. Їх рухливість підвищується при зростанні концентрації пов’язаних неестерифікованих жирних кислот. Зниження електрофоретичної рухливості β-ліпопротеїнів спо- стерігається при зменшенні вмісту іонів Са 2+ у буфері, що ви- користовується. зона Ця частина електрофореграми представлена го- ловним чином третім компонентом комплементу (С. Цей бі- лок дуже лабільний, що необхідно враховувати при приготу- ванні зразків і проведенні електрофорезу. зона Інтенсивність і ширина цієї зони електрофоре- грами обумовлені головним чином присутністю різних підкла- сів IgG. Висока концентрація IgG впливає на інтенсивність забарвлення анодної частини γ-зони. При дослідженні плазми крові в анодній частині фронту зони виявляється смуга фібри- ногену. С-реактивний білок рухається на катодному боці зони основної маси IgG і виявляється як окрема смуга при гострому і хронічному запаленні. У ряді випадків в γ-зоні виявляється область з декількох смуг, що обумовлюється проліферацією деяких клонів Ig-клітин, наприклад після вірусної інфекції або при канцерогенезі. Основні типи электрофореграм Гострий запальний процес. Електрофореграма цього типу характеризується деяким зниженням концентрації альбумі- ну на тлі значного зростання α 1 і α 2 -фракцій (рис. 2.7). Конце- нтрація загального білка сироватки крові, як правило, залиша- ється в межах норми. Розділ 2. Методи дослідження в гематології 45 На ранніх стадіях інфекційного процесу в області γ-глобулінової фракції можуть з’являтися олігоклональні сму- ги, обумовлені стимуляцією окремих клонів плазмоцитів, що продукують відповідні антитіла до специфічного антигену. У пізні терміни ці смуги зникають. У разі підгострого запального процесу може відзначатися збільшення β-глобуліновой фракції. Рис. 2.7. Гострий запальний процес (денситограма) Хронічний запальний процес. Характерною особливістю хронічного запального процесу є деяке зниження альбумінової і, можливо, β-глобулінової фракцій на тлі збільшення α 1 і α 2 -глобулінових фракцій, а також помітне зростання γ- глобулінів, що носить поліклональний характер (рис. 2.8). Рис. 2.8. Хронічний запальний процес (денситограма) Цей тип електрофореграми характерний для довготрива- лих інфекційних і алергічних захворювань, неопластичних процесів, захворювань сполучної тканини. Дифузний гепатодегенеративний процес. Ушкодження паренхіми печінки, як правило, призводять до зниження про Гематологія 46 дукції специфічних білків і зменшення площі всіх фракцій, за винятком γ-глобулінової (рис. 2.9). Рис. 2.9. Дифузний гепатодегенеративний процес (денситограма) Зовнішній вигляд електрофореграми багато в чому за- лежить від типу гепатиту, важкості і тривалості захворювання. Хронічний гепатит характеризується підвищенням рівня IgG і IgM зі зниженням рівня альбуміну і трансферину. Нерідко електрофореграма є сумішшю типів, характерних для гострого і хронічного запальних процесів, а також поліклональної гам- мапатії. Показано, що при гепатиті А на ранніх стадіях збіль- шується вміст кислого глікопротеїну і α 1 -антитрипсину, то- ді як при гепатиті В концентрація кислого глікопротеїну залишається в межах норми. Рівень гаптоглобіну зростає при гепатиті А і знижується при гепатиті В. Найчастіше електро- форетична картина білків сироватки крові при гепатиті вигля- дає таким чином — не виявляється ніяких змін у порівнянні з нормальною електрофореграмою; — відзначається зниження тільки альбумінової фракції, що відображає ушкодження гепатоцитів з невеликими змінами інтерстиціальної тканини; — підвищується тільки γ-глобулінова фракція, що відо- бражає переважне ушкодження інтерстиціальної тканини; — спостерігається зниження альбумінової фракції і зро- стання всіх глобулінових фракцій, причому збільшення α-фракцій є прогностично сприятливою ознакою. Цироз печінки Електрофоретична картина при цирозі печінки характе- ризується зниженням альбумінової і α 1 -, α 2 -глобулінових фра- кцій при збільшенні частки β- і γ-глобулінів (рис. 2.10). Розділ 2. Методи дослідження в гематології 47 Рис. 2.10. Цироз печінки (денситограма) Відмітною особливістю цього типу електрофореграм є наявність так званого «містка» між β- і γ-глобулінами, що утворюється в результаті зростання рівня IgA на тлі підвище- ної продукції IgG. Аліментарна гіпопротеїнемія. Причиною цього типу гі- попротеїнемії може бути недостатнє споживання білка і (чи) неадекватна абсорбція амінокислот, що проявляється при таких патологічних станах, як синдром мальабсорбції, тропічна лихоманка, алкоголізм, голодування та ін. Недостатнє над- ходження амінокислот в організм призводить до зниження синтезу білка, що в першу чергу впливає на вміст альбуміно- вої фракції. Концентрація загального білка в сироватці крові також знижується, тоді як відносний відсотковий вміст α 1 -, α 2 - і γ-глобулінів може бути в нормі або трохи підвищеним (рис. 2.11). Рис. 2.11. Аліментарна гіпопротеїнемія (денситограма) Неселективна втрата білка. При неселективній втраті білка спостерігається зниження загальної концентрації білка. Електрофореграма, як правило, характеризується зниженням Гематологія 48 альбумінової фракції, іноді β-глобулінів, деяким зростанням α 1 -глобулінової фракції (рис. 2.12). Рис. 2.12. Неселективна гіпопротеїнемія (денситограма) Залежно від механізму втрати білка можна виділити 5 видів неселективної гіпопротеїнемії: 1. Утрата білка внаслідок опіків, ексудативних дермато- патій. Найбільш характерною рисою при цьому типі гіпопро- теїнемії є зменшення частки альбуміну, трансферину і С 3 -компонента комплементу при зростанні α 1 - і α 2 - глобулінових фракцій, а також зниження γ-глобулінів, що вка- зує на зростання вірогідності вторинного інфікування. 2. Утрата білка в результаті гастроентеропатії. Причиною втрати білка при гастроентеропатіях може бути шлунко- во-кишкова кровотеча, порушення проникності стінки капіля- рів і слизової оболонки шлунково-кишкового тракту, а також порушення транспорту амінокислот. Електрофореграма при цьому виді гіпопротеїнемії буде характеризуватися значним зниженням частки альбуміну, частка α-глобулінів може зрос- ти, частка γ-глобулінів — зменшитися. 3. Утрата білка внаслідок плазмаферезу і втрати крові. На електрофореграмі цього типу спостерігатиметься зниження піку альбуміну з можливим зростанням α 1 -, α 2 - і β-глобулінів. Частка γ-глобулінів може залишатися в межах норми або бути трохи підвищеною. 4. Утрата білка, зумовлена ексудативними легеневими захворюваннями. Для цього типу гіпопротеїнемії характерне зниження рівня альбумінової фракції і β-глобулінів на тлі збі- льшення α 1 - і α 2 -глобулінових фракцій. 5. Есенціальна гіпопротеїнемія. Особливістю подібної гіпопротеїнемії є дуже сильне зниження концентрації альбу- Розділ 2. Методи дослідження в гематології 49 міну, причина якого до теперішнього часу остаточно не з’я- сована. Селективна протеїнурія (нефротичний синдром).Селек- тивна втрата білка обумовлена підвищеною, але виборчою проникністю гломерулярного апарату нирок, унаслідок чого спостерігається зниження низько- і середньомолекулярних білків сироватки крові (альбумін, α 1 -антитрипсин, трансферин) і відносне підвищення концентрації високомолекулярних біл- ків (α 2 -макроглобулін, ліпопротеїни, IgM). Нефротичний синдром, що викликається найрізноманітнішими причинами, за- звичай характеризується гіпопротеїнемією, гіпоальбумінемі- єю, набряками, гіперліпемією, протеїнурією і ліпідурією. Однією з особливостей електрофореграми при селектив- ній протеїнурії є значне зростання α 2 -глобулінової фракції, передусім за рахунок α 2 -макроглобуліну. Відзначається також збільшення β-ліпопротеїнів унаслідок відносного зростання апо-В білків, що входять до складу ліпопротеїнів, багатих три- гліцеридами. Вміст гаптоглобінів генетичних фенотипів 1-2 і 2-2, що мають високу молекулярну масу, також підвищується, проте вміст гаптоглобіну типу 1-1 може знижуватися. Віднос- на концентрація α 1 -глобулінової фракції, незважаючи на втра- ту α 1 -антитрипсину, може залишатися в межах норми або на- віть підвищуватися за рахунок затримки α-ліпопротеїнів рис. 2.13). Рис. 2.13. Селективна гіпопротеїнемія (денситограма) Гіперліпідемія. Характерною особливістю електрофоре- грами при гіперліпідемії є значне збільшення β-глобулінової фракції, причому деяке її зміщення до фракції α 2 -глобулінів, яке обумовлене підвищенням вмісту ліпопротеїнів низької Гематологія 50 щільності, розташованих між цими двома фракціями. При збі- льшенні вмісту ліпопротеїнів високої щільності може спосте- рігатися зростання α 1 -глобулінової фракції (рис. 2.14). Рис. 2.14. Гіперліпідемія (денситограма) Наявність дисліпопротеїнемії, а також визначення її типу може бути виявлене шляхом біохімічного дослідження си- роватки крові на вміст загального холестерину, тригліцеридів, крім того, шляхом безпосереднього проведення електрофорезу ліпопротеїнів. Залізодефіцитна анемія. Електрофореграма цього типу характеризується збільшенням вмісту β-глобулінової фракції внаслідок зростання вмісту трансферину (рис. 2.15). Рис. 2.15. Залізодефіцитна анемія (денситограма) Гемолітична анемія. Найбільш характерною особливі- стю цього типу електрофореграми є виражене зниження α 2 -глобулінової фракції внаслідок зниження концентрації гап- тоглобіну. Проте причина, що викликала гемоліз, може сама по собі істотно ускладнити інтерпретацію отриманої електро- фореграми. Так, при аутоімунному генезі гемолітичної анемії спостерігатиметься зростання γ-глобулінової фракції за раху- Розділ 2. Методи дослідження в гематології 51 нок IgG і IgM на тлі зниження С і С 4 -компонентів комоле- менту (рис. 2.16). Рис. 2.16. Гемолітична анемія (денситограма) Вагітність. У результаті вагітності в організмі жінки відбуваються певні фізіологічні процеси, що призводять до деякої зміни вмісту білків у сироватці крові. При нормальному перебігу вагітності в результаті зростання об’єму плазми дещо знижується частка альбумінової фракції (рис. 2.17). Під час останнього триместру вагітності може спостерігатися збіль- шення α 1 -глобулінової фракції за рахунок кислого гліко- протеїну. Зростання і β-глобулінових фракцій можливо за рахунок α 2 -макроглобуліну, церулоплазміну, β-ліпопротеїнів і трансферину. Як правило, може спостерігатися деяке зростан- ня γ-глобулінової фракції. Рис. 2.17. Вагітність (денситограма) Слід зауважити, що прийом оральних контрацептивів, а також гіперестрогенізм можуть викликати подібні зміни на електрофореграмі. Поліклональні гаммапатії. Відмінною рисою поліклона- льних гаммапатій є загальне зростання піку γ-глобулінів, представлених гетерогенною групою імуноглобулінів, що продукуються різними клонами плазматичних клітин Гематологія 52 рис. 2.18). Вміст альбуміну в цих випадках зазвичай дещо знижений. Рис. 2.18. Поліклональна гаммапатія (денситограма) Поліклональні гаммапатії можуть визначатися при різ- них патологічних станах інфекційних захворюваннях, ауто- імунних агресіях, ревматичних процесах, нефротичному синд- ромі, хронічних захворюваннях печінки, гастро- і спленекто- мії, саркоїдозі, колагенозах, бронхіальній астмі, подагрі, тала- семії, злоякісних новоутвореннях та ін. У пацієнтів з виявленою поліклональною гаммапатією невідомого генезу доцільно проводити кількісне дослідження індивідуальних імуноглобулінів. Моноклональні гаммапатії.Моноклональні гаммапатії є наслідком накопичення в сироватці крові окремих імуногло- булінів або їх фрагментів. Характерними особливостями елек- трофореграми при цьому можуть бути: — формування вузької зони (гострого піку денситогра- ми, так званого «M»-градієнта; — поява «парапротеїнів» між β- і γ-глобуліновими фра- кціями; — різке посилення анодного (чи катодного) краю β- і γ-фракцій (рис. 2.19). Рис. 2.19. Моноклональна гаммапатія (денситограма) Розділ 2. Методи дослідження в гематології 53 Інтерпретація електрофореграм хворих на моноклональ- ну гаммапатію може викликати певні труднощі. Зростання вмісту моноклональних білків є результатом лімфопроліфера- тивної відповіді на певну форму антигенної стимуляції, тому необхідно з’ясувати, чим зумовлена ця відповідь: — присутністю інфекційного процесу; — присутністю видозміненого білка; — гіперчутливістю; — наявністю злоякісного новоутворення. Принципово моноклональні гаммапатії можна розділити натри групи: |