Микроба. микроба. Поняття інфекційний процес та інфекційне захворювання
 Скачать 230.39 Kb.
|
РСК: механізми, роль окремих інгредієнтів, техніка постановки і діагностичне застосування.Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), происходит связывание комплемента комплексом антиген - антитело. Если же комплекс антиген - антитело не образуется, то комплемент остается свободным. PCK проводят в две фазы 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей антиген + антитело + комплемент, 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген - антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная)-(пациэнт болен). Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз (реакция отрицательная)-(пациэнт здоров). Реакція віруснейтралізаціі. Модифікація РН - кольорова проба. Реакція вірус-нейтралізації гальмування гемаглютинації. РН – специфічні АТ сироватки нейтралізують інфекційну активність вірусу. Це можна перевірити при зараженні комплексом АГ-АТ чутливих клітин культур. Принцип реакції ґрунтується на взаємодії специфічних антитіл імунної сироватки з вірусом, яке призводить до нейтралізації останнього. Реакцію можна ставити в культурах клітин з обліком результатів за цитопатичною дією, в кольоровій пробі, за допомогою рН-метрії та феноменом бляшкоутворення. Крім того можна використати для постановки реакції інші живі системи – курячі ембріони та лабораторні тварини Прививченні нейтралізації цитопатичної дії вірусів в культурі клітин компонентами реакції є вірус місткий матеріал (культуральнарідина, інфіковані або дезінтегровані культури клітин), імунна противірусна сироватка, спеціальні живильні середовища (сольовий розчин Хенкса, середовища Ігла, 199 тощо) та культура клітин у пробірках або флаконах. Її підбирають залежно від біологічних властивостей вірусів. Найчастіше використовують культури клітин HeLa, СМЦ, нирок мавп, первинні культури клітин курячих чи людських ембріонів. Кольорова проба передбачає, що при взаємодії вірусів з культурою клітин останні гинуть, рН середовища залишається лужним, і колір індикатора не змінюється. При нейтралізації вірусів антитілами специфічної сироватки або при відсутності відповідних вірусів створюються умови для розвитку культур клітин. Вони залишаються живими, активно здійснюють обмін речовин, внаслідок чого утворюються продукти клітинного метаболізму, які зсувають рН середовища в кислу сторону. Це приводить до зміни кольору індикатора фенолроту з червоного (лужне рН) на солом’яно-жовтий або оранжевий (кисле значення рН). При постановці реакції спочатку змішують 0,25 мл досліджуваного вірус місткого матеріалу, з різними розведеннями специфічної противірусної імунної сироватки. Після 30-60-хвилинної інкубації при температурі 37 °С у пробірки додають по 0,25 мл клітинної суспензії з індикатором фенолротом і заливають їх шаром вазелінової олії або закривають резиновими корками. Пробірки витримують у термостаті при 37 °С протягом одного тижня, а потім читають результати. При позитивному тесті в дослідних пробірках спостерігають зміну кольору індикатора з червоного на оранжевий. Оцінити результати реакції можна також безпосередньо вимірюючи значення рН середовища за допомогою іонометра. Кольорову пробу особливо часто використовують для лабораторної діагностики поліомієліту. Імуноферментний аналізІмуноферментний метод заснований на обліку реакції антигенантитіло, причому як мітка, що дозволяє виявити імунний комплекс, використовують ферменти, наприклад пероксидазу, лужну фосфатазу. Одним із поширених варіантів теста ІФА є твердофазний метод «Сендвіч - метод»: спочатку на стінках полістиролових пробірок сорбують антитіла проти певного антигена. У цю ж пробірку вносять досліджуваний біологічний зразок. Якщо там містяться шукані антигени, вони взаємодіють з антитілами і разом з ними фіксуються на стінках пробірки. Після цього в пробірку вводять антитіла до даного антигена, що мітяться ферментом, які також приєднуються до імунного комплексу, що утворився, і залишаються на стінках пробірки. Для виявлення і кількісної оцінки цих комплексів в пробірку додають перекис водню (Н2О2) і хромогени. Фермент (пероксидаза) розщеплює Н2О2 з виділенням кисню. Останній окисляє хромоген, який набуває жовтого кольору. Інтенсивність фарбування і, відповідно, кількість шуканого антигена оцінюють фотометрично. Етапи проведення ІФА: 1.Інокуляція біоматеріалу і реактивів у лунки планшетів полістиролової мікротест системи (на яких сорбовані антитіла проти певного антигена і ферменту). 2.Термостатування і струшування на шейкері для рівномірного перемішування реакційної суміші в лунках планшета. 3.Промивка лунок планшета на вошері (автоматичний промивник планшетів) - для відмивання субстанцій, що не зв'язалися (антитіл, кон'ю- гата і ін.). 4.Додавання забарвленого субстрата (хромогена). 5.Реєстрація результату на рідері (спектрофотометрі, фотоколориметрі для визначення оптичної щільності досліджуваного розчину в лунках планшета). Останніми роками для кількісного радіоімунного і імуноферментного визначення різних антигенів і антитіл в біологічних середовищах все частіше використовують так звані моноклональні антитіла. Останні отримують не шляхом імунізації тварин, а штучно, шляхом синтезу так званих моноклонів, тобто культури клітин, що походять із одного сенсибілізованого лімфоцита. Моноклональні антитіла відрізняються від звичайних антитіл, отриманих за допомогою класичної імунізації тварин, дуже високою специфічністю і реагують тільки на певний антиген. |