Микробиология. билеты все (копия). Строение бактериальной клетки. Споры и капсулы структура, расположение в клетке. Значение для бактериальной клетки. Методы обнаружения спор и капсул. Методы обеззараживания спороносной культуры
 Скачать 382.85 Kb.
|
|
Четвертый день исследования Вынимают посевы из термостата, учитывают резуль-тат. Делают мазки из культуры, выросшей на среде с сывороткой, и окрашивают их синим Леффлера. Наличие в мазках характерных по морфологии пало-чек, черного с облачком стержня в среде Пизу и линий преципитации в агаре позволяет дать предварительный ответ: «Обнаружены коринебактерии дифтерии». Исследование продолжают. При отсутствии линий преципитации в агаре или их недостаточной четкости исследование на токсигенность обязательно повторяют с выделенной чистой культурой. Для окончательной идентификации выделенной культуры и определения биовара возбудителя производят посев на глюкозу, сахарозу, крахмал и бульон с мочевиной (для выявления фермента урезы). Посев на среды делают обычным способом. Проба на уреазу. Выделенную культуру засевают на бульон с мочевиной и индикатором (крезоловый красный) и ставят в термостат. Уже через 30- - 40 мин можно учитывать результат: при посеве истинных возбудителей дифтерии цвет среды не изменяется, так как они не содержат уреазу. Псевдодифтерийные палочки расщепляют мочевину и изменяют индикатор - среда приобретает малиново-красный цвет. 3. От больного, госпитализированного в дизентерийное отделение с диагнозом «Дизентерия тяжёлой формы», бактериологической 1.холера 2. Идентификация проводится по следующим показателям: гр отрицательный, определениеподвижности в раздавленной и висячей капле-положительна, агглютинация холерной О-сывороткой- положит. Ферментация углеводов: лактоза-, глюкоза+,сахароза +,арабиноза-, маннит+, мальтоза +, манноза+, дульцит-. Протеолитические свойства:не разлогает мочевину, разлогает желатин, пептонизирует молоко, восст нитраты в нитриты.Диастатические св-ва: разлагает крахмал.Гемолизирует эритроциты барана, образует ацетилкарбинол (реакция Фогесса-Проскауэра), образует декарбоксилазу..Не чувствителен к 4 типу фанат Мукерджи, чувствителен к Эльтор 2. 3. ферментация углеводов, протеолитические и гемолитические свойства, чувствительность к фагам 22 билет. Получение и применение лечебных и диагностических иммунных сывороток. Получение и применение лечебных иммунных сывороток. Сывороточные препараты применяют для создания искусственного пассивного иммунитета. К ним относят специфические иммунные сыворотки и иммуноглобулины. Эти препараты содержат готовые антитела. Их получают из крови доноров - специально проиммунизированных людей или животных (против кори, гриппа, столбняка). Кроме того, используют сыворотку переболевших и даже здоровых людей, если в ней содержится достаточное количество антител. В качестве сырья для приготовления иммунных препаратов используют также плацентарную и абортную кровь. Имеются антибактериальные и антитоксические сыворотки. Первые имеют более ограниченное применение. Антитоксические сыворотки применяют для лечения дифтерии, столбняка, ботулизма и др. Эти сыворотки выпускают с определенным содержанием антитоксина, которое измеряют в международных единицах (ME). Иммунные сывороточные препараты получают из крови животных, главным образом лошадей, многократно иммунизированных. По окончании иммунизации определяют уровень антител в крови и делают кровопускание. Полученную сыворотку консервируют, контролируют ее стерильность, активность и физические свойства. Препараты, полученные из крови лошадей, содержат чужеродные для человека белки, которые при повторном введении могут вызвать аллергические реакции: сывороточную болезнь и анафилактический шок. Для предупреждения осложнений сывороточные препараты следует вводить с предосторожностями (по Безредке) Для освобождения сывороток животных от балластных белков и концентрации антител применяют различные методы, основным из которых является метод "Диаферм-3", разработанный в нашей стране и включающий ферментативный гидролиз балластных белков. Кроме того, для концентрации антител в меньшем объеме препарата разработаны методы выделения из сыворотки крови гамма-глобулинов, содержащих антитела. Такие препараты называют иммуноглобулинами. Их готовят из сыворотки человека (гомологичные) и животных (гетерологичные). Эффективность иммуноглобулинов гораздо выше эффективности иммунных сывороток, а осложнений наблюдается несоизмеримо меньше. В настоящее время иммуноглобулины применяют гораздо более широко, чем сыворотки. В нашей стране иммуноглобулины используют для профилактики кори, гепатита, краснухи и др. Профилактическое введение иммуноглобулинов проводят при подозрении на заражение или при заражении. Целесообразно вводить эти препараты в первые дни после заражения (начало инкубационного периода), пока патологический процесс еще не развился. При лечебном применении препарата раннее его введение дает больший эффект. Сыворотки и иммуноглобулины вводят внутримышечно и внутривенно. Своевременное и правильное использование сывороточных препаратов позволяет снизить заболеваемость многими инфекциями. Получение и применение диагностических иммунных сывороток. Иммунные сыворотки получают из крови людей или животных (чаще кроликов и лошадей), иммунизированных по определенной схеме соответствующим антигеном (вакциной). В полученной сыворотке определяют ее активность (титр), т. е. наибольшее разведение, в котором она реагирует с соответствующим антигеном в определенных условиях опыта. Готовят сыворотки обычно на производстве. Их разливают в ампулы, на которых указывают название и титр. В большинстве случаев сыворотки высушивают. Сухую сыворотку перед употреблением растворяют в дистиллированной воде до первоначального объема (тоже указан на этикетке). Хранят все сухие (лиофилизированные) диагностические" препараты при 4-10° С. Для серологических исследований применяют иммунные сыворотки нативные (не адсорбированные) и адсорбированные. Недостаток нативных сывороток - наличие в них групповых антител, т. е. антител к микроорганизмам, имеющим общие антигены. Обычно такие антигены встречаются у микробов, принадлежащих к одной группе, роду, семейству. Адсорбированные сыворотки отличаются строгой специфичностью: реагируют только с гомологичным антигеном. Антитела к другим (гетерогенным) антигенам удалены адсорбцией. Титр антител адсорбированных сывороток низкий (1:40, 1:320), поэтому их не разводят*. Возбудители воздушно-капельных бактериальных инфекций. Микобактерии. Характеристика биологических свойств возбудителей туберкулеза. Методы микробиологической диагностики туберкулеза. Представители семейства микобактерий Mycobacteriaceae имеют вид тонких, иногда ветвистых палочек, чем напоминают гриб. Медленный рост на питательных средах также сближает их с грибами. Эти особенности объясняют название семейства, рода - Mycobacterium.Род микобактерий включает патогенных и непатогенных представителей. Патогенными для человека являются возбудители туберкулеза и возбудитель лепры. Существуют несколько видов туберкулезных палочек: 1. Человеческий - Mycobacterium tuberculosis 2. Бычий - Mycobacterium bovis 3. Птичий - Mycobacterium avium 4. Мышиный - Mycobacterium murium 5. Встречаются микобактерий, вызывающие заболевания у холоднокровных. К ним относится особая группа атипичных микобактерий. В настоящее время атипичные микобактерий приобретают особое значение. Их делят по ряду признаков на 4 группы: I, II, III, IV (по Раньону). Они отличаются от микобактерий туберкулеза меньшей требовательностью к питательным средам. Между собой они различаются по отношению к питательным средам, скорости роста, по способности образовывать пигмент, а также по каталазной и пероксидазной активности. Вызывают заболевания у человека представители групп I и III. Морфология. Возбудители туберкулеза были открыты р. Кохом в 1882 г. Это тонкие палочки величиной 1,5-4 × 0,3-0,5 мкм. Они очень полиморфны: встречаются прямые, изогнутые, колбовидные. Имеются кислотоподатливые формы и очень мелкие, так называемые зерна Муха. Разнообразие форм нередко зависит от состава среды, воздействия на них антибиотиков и химиотерапевтических средств. Бактерии туберкулеза неподвижны, не имеют спор и капсул. Грамоположительны, однако они плохо воспринимают анилиновые краски. Хорошо окрашиваются в красный цвет по методу Циля- Нильсена. Культивирование. Возбудители туберкулеза - аэробы. Растут при температуре 37-38° С и рН среды 5,8-7,0, Особенность туберкулезной палочки являются медленный рост и требовательность к питательным средам. Первично они растут только на специальных средах: среде Петраньяни, Петрова, Левенштейна - Йенсена. Также выращивают на глицериновом бульоне, глицериновом агаре, глицериновом картофеле.,на синтетических средах, например среде Сотона. Глицерин стимулирует рост микобактерий. М. bovis не нуждаются в глицерине. Наибольшее распространение получила среда Левенштейна –Йенсена,пользуются также средой Финна II, которая отличается от среды Левенштейна - Йенсена тем, что вместо аспарагина в ней используется глутамин натрия. На этой среде микобактерий туберкулезарастут несколько быстрее, чем на среде Левенштейна - Йенсена, и процент выделения культур выше.. Микобактерий туберкулеза встречаются в R- и S-форме. Более вирулентной является R-форма (М. bovis чаще встречается в R-форме). На плотных питательных средах возбудители туберкулеза образуют сухие морщинистые колонии кремового цвета с чуть приподнятым Центром и изрезанными краями .В жидких питательных средах микобактерий туберкулеза вырастают на 10-15-й день в виде пленки, которая постепенно утолщается, становится грубой, морщинистой, ломкой и в силу тяжести иногда падает на дно. Бульон под пленкой остается прозрачным. Ферментативные свойства. Возбудители туберкулеза биохимически мало активны. У них обнаружен протеолитический фермент, который в определенных условиях (кислая и щелочная среда) расщепляет белок. Они расщепляют также некоторые углеводы, образуют уреазу. Но свойства эти непостоянны. Поэтому изучение ферментов не имеет диагностического значения. Токсинообразование. Возбудители туберкулеза образуют эндотоксин - это белковое вещество впервые выделил Р. Кох (1890) и назвал его туберкулином. "Старый" туберкулин - это культуральная жидкость, полученная при росте культуры в глицериновом бульоне и выпаренная при 70° С до 1 /10своего первоначального объема. "Новый" туберкулин - очищенный белковый дериват туберкулина. Туберкулин обладает свойствами аллергена. Он не оказывает токсического действия на здоровый организм. Его действие проявляется только в зараженном организме. Поэтому введение туберкулина используют с диагностической целью, в постановках аллергических проб (Пирке или Манту). Для этой цели туберкулин готовят из бычьего типа микобактерий туберкулеза. Вирулентные штаммы возбудителей туберкулеза содержат особый липид корд-фактор, который способствует склеиванию микобактерий и росту их в виде кос и тяжей. Антигенная структура. Микобактерий туберкулеза содержат антиген, в который входят белковые, липоидные и полисахаридные факторы. Этот антиген вызывает в организме выработку антител (агглютининов, преципитинов, комплементсвязывающих веществ и др.). Однако эти антитела обнаруживаются в малых концентрациях, поэтому практически с целью диагностики мало используются. Материал для исследования 1. Мокрота (туберкулез легких и бронхов). 2. Экссудат из плевральной полости (туберкулез легких, плевры). 3. Асцитическая жидкость и кал (кишечная форма туберкулеза). 4. Моча (туберкулез почек). 5. Спинномозговая жидкость (туберкулезный менингит). 6. Кровь (генерализация процесса). Основные методы исследования 1. Бактериоскопический. 2. Люминесцентный. 3. Бактериологический 4. Биологический. 5. Аллергический. Ход исследования Метод прямой микроскопии Мокрота:Полученную мокроту выливают в чашки Петри.Специальной препаровальной иглой извлекают гнойные комочки, переносят на предметное стекло иделают мазки, растирая материал между двумяпредметными стеклами. Мазки окрашиваютпо методу Циля- Нильсена и микроскопируют с иммерсионной системой. Окрашенные вкрасный цвет микобактерии располагаются отдельноили группами. Просмотреть нужно не менее 80- 100полей зрения, так как микобактерии туберкулезамогут быть обнаружены, если в 1 мл мокроты их неменее 100 000. При отсутствии в мазках микобактерийрий туберкулеза прибегают к методам обогащения.Чаще всего пользуются методом флотации. Метод флотации Мокрота: 10-15 мл мокроты помещают в бутылку вместимостью 250 мл и добавляют примерно равное количество 0,5% раствора гидроксида натрия или калия. Бутылку закрывают плотной пробкой, ,в течение 5- 10 мин тщательно встряхивают в аппарате для встряхивания или ручным способом. Мокрота при этом гомогенизируется. Добавляют 100 мл дистиллированной воды и 0,5 мл ксилола, бензола или толуола, относительная плотность которых меньше, чем у воды. Затем содержимое бутылки вновь встряхивают в течение 5-10 мин, доливают дистиллированной воды до горлышка бутылки (вода должна быть свежеперегнанной). Через 30 мин после добавления воды на поверхности образуется сливообразное флотационное кольцо, состоящее из капелек ксилола, бензола или толуола с захваченными бактериями. Пленку осторожно отсасывают пастеровской пипеткой с резиновым баллоном, подсушивают на специальной воздушной бане и переносят на предметное стекло. После подсыхания на мазок вновь наносят материал и так делают 3-4 раза для концентрации материала. Подсохшие мазки фиксируют, окрашивают по Цилю – Нильсену и микроскопируют. Микобактерии располагаются отдельно или группами Экссудат из плевральной полости :Экссудат центрифугируют, из осадка делают маз- ки и окрашивают по Цилю- Нильсену. При флотации экссудат помещают в стеклянную колбу, добавляют 2 мл 0,5% водного раствора гидроксида натрия или калия, встряхивают 10 мин, далее поступают так же как и с мокротой. Образовавшееся флотационное кольцо наносят на предметное стекло, после подсыхания наслаивают еще 2-3 раза, подсушивают, фиксируют, окрашивают и микроскопируют Асцитическую жидкость: исследуют бактериоскопически так же, как экссудат из полости плевры. Моча:Собранную мочу центрифугируют в течение 15-20 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают в дезинфицирующий раствор. Из осадка делают мазки, высушивают, фиксируют, окрашивают по Цилю- Нильсену и микроскопируют. При отсутствии микобактерий в мазках осадок флотируют так же, как плевральную и асцитическую .жидкость СМЖ:Пленку, образовавшуюся (при стоянии) на поверхности спинномозговой жидкости, специальным шпателем переносят на предметное стекло, высушивают, фиксируют, окрашивают по Цилю - Нильсену и микроскопируют. Если микроскопическое исследование материала с применением методов обогащения не дает положительного результата, то прибегают к другим методам исследования: люминесцентной микроскопии, посеву, биологическому методу. Люминесцентно-микроскопический метод Этот метод в последнее время приобретает особое значение . Бактериологический метод Мокрота и др. патолог матер: Культуральный метод позволяет выявить микобактерии туберкулеза, если их содержится в исследуемом материале около 100 в 1 мл, и, кроме того, изучить выделенную культуру, определить чувствительность ее к противотуберкулезным препаратам. Бактериологическому исследованию подвергается самый различный материал: мокрота, промывные воды бронхов, желудка, экссудат, моча, спинномозговая жидкость и т. д. При посеве нужно освободить исследуемый материал от сопутствующей флоры. Наиболее принятым методом является обработка исследуемого материала трехзамещенным фосфатом натрия, который угнетает сопутствующую флору. Этот реактив является щадящим для туберкулезных палочек и допускает длительную экспозицию патологического материала без нарушения жизнеспособности микобактерий туберкулеза. Обработка состоит в добавлении к исследуемому материалу равного по объему количества 10% трехзамещенного фосфата натрия и инкубации этой смеси при 37°С в термостате в течение 24 ч. После инкубации материал центрифугируют, надосадочную жидкость сливают в дезинфицирующий раствор; к осадку добавляют 1 мл натрия хлорида и засевают по 0,5 мл на 3 пробирки яичной среды. Обработка фосфатом натрия удобна тогда, когда исследуемый материал приходится сохранять до посева в течение некоторого времени (1-2 дня). Для повышения высеваемости микобактерий целесообразно делать посев патологического материала на две среды - Левенштейна - Йенсена и на среду Финна II. Посевы проверяются каждые 7-10 дней. Большинство посевов дает рост возбудителя туберкулеза в течение двух месяцев. При отсутствии роста к этому времени посев считается отрицательным. Во избежание высыхания среды пробки заливают парафином либо на них надевают резиновые колпачки. Ускоренные методы Для ускоренной диагностики используют метод микрокультур Прайса: на предметных стеклах (на 1/3 стекла ближе к его концу) делают толстые мазки из исследуемого материала. Мазки высушивают, обрабатывают несколько минут 2-6% серной кислотой, промывают стерильным изотоническим раствором натрия хлорида. Затем стекла опускают во флаконы с гемолизированной цитратной кровью в разведении 1:4- 1:8 и ставят в термостат. Через несколько дней (3-7- 14) стекла извлекают, фиксируют препарат, окрашивают по Цилю- Нильсену и микроскопируют. Вирулентные штаммы образуют микрокультуры, имеющие вид кос, жгутов (корд-фактор). Биологическая проба Самыми чувствительными животными к микобактериям туберкулеза человеческого типа являются морские свинки. Введение одной микробной клетки вызывает заболевание и гибель животного. В опыт берут морских свинок массой 250-300 г. Незагрязненный материал вводят без специальной обработки. Патологический материал, загрязненныйпосторонней флорой (мокрота, гной, кал), предварительно обрабатывают 3-5% водным раствором стерильной серной кислоты, которую затем отмывают стерильным изотоническим раствором натрия хлорида. Исследуемый материал центрифугируют, полученную взвесь (1-1,5 мл) вводят под кожу в области паха морской свинки. При наличии в материале микобактерий туберкулеза через 10-12 дней в месте введения образуется уплотнение, переходящее в язву. Регионарные лимфатические узлы увеличиваются и спаиваются. Гибель морской свинки наступает через 2-3 мес в результате генерализации процесса. Из органов делают мазки, мазки- отпечатки и изучают их. |