Коллоидная химия В.Н. Сергеев. В. Н. Сергеев Курс коллоидной химии для медицинских вузов. Учебник
 Скачать 3.98 Mb.
|
|
3.3.3. Ионообменная хроматография В молекулярно-ситовой хроматографии макромолекулы разделяют по их размерам если неподвижная фаза содержит заряженные группы, то можно разделять молекулы по знаку и величине заряда. В ионообменной хроматографии в качестве неподвижной фазы применяют ионообменные смолы — аниониты и катиониты. Их получают введением в органические носители на основе полистирола или декстрана ионогенных групп SO 3 H, PO 3 H 2 , COOH — для получения смол с отрицательно заряженными группами — катионитов или NR 2 , NHR, NH 2 — для получения смол с положительно заряженными группами — анионитов, (рис. 3.5). Рис. 3.5. Схема строения частиц адсорбентов в ионообменной хроматографии а) катионитов, б) анионитов 30 С помощью ионообменной хроматографии можно разделять смеси фенолов и карбоновых кислот (на анионитах, аминосахаров, нуклеотидов, нуклеозидов, пуриновых, пиримидиновых и других оснований (на катионитах, аминокислот, белков, нуклеиновых кислот. Все указанные вещества являются электролитами, а аминокислоты, нуклеиновые кислоты и белки — амфолитами. Рассмотрим, например, разделение методом ионообменной хроматографии смеси аминокислот. Вводных растворах аминокислоты существуют в виде равновесных смесей катионных и анионных форм и диполярных ионов. Положение равновесия зависит от pH среды. В сильнокислой среде (pH 1 – 2) преобладают катионные формы, а в сильнощелочной (pH 13 – 14) — анионные. R C H C N H 2 O O ê àòè î í í àÿ ô î ð ì à (ñè ë üí î ê è ñë àÿ ñð åä à) ä è ï î ë ÿð í û é è î í àí è î í í àÿ ô î ð ì à (ñè ë üí î ù åë î ÷í àÿ ñð åä à) + R C H C N H 3 O O H + R C H C N H 3 O O H + (II) + H + (I) H + (III) + Для анализа смеси аминокислот pH их раствора доводят до 3, а затем пропускают через колонку, заполненную катионообменной смолой (например, сульфированным полистиролом в форме натриевой соли, обозначим его RSO 3 – Na + ). При этом аминокислоты в результате ионного обмена будут связываться со смолой согласно уравнению Ak + + RSO 3 – Na + RSO 3 – Ak + + Катионы основных аминокислот связываются со смолой прочнее, чем катионы нейтральных, еще менее прочно со смолой связываются катионы кислых аминокислот. Если теперь колонку промывать растворами с повышающимися значениями pH (от сильнокислого до нейтрального и дальше до сильнощелочного), то катионы аминокислот будут десорбироваться направление реакции (II) и (III)) и уходить с колонки в элюенте. Первыми будут элюироваться катионы кислых аминокислот, потом нейтральных и, наконец, основных аминокислот. 3.3.4. Б и оспе ц и фи ческа я хроматография (аффинная, б ио аффинная, хроматография пос родству) Биоспецифическая хроматография позволяет исключительно селективно выделять и очищать конкретный биополимер из обычной для первых стадий выделения смеси макромолекул. Она основана на специфическом связывании биомакромолекул с лигандами, ковалентно присоединенными к нерастворимым носителям. В качестве лигандов используются соединения, взаимодействие которых с выделяемыми веществами основано на биологической функции последних.Например, при выделении белков-ферментов лигандами служат их ингибиторы, при выделении антител или антигенов — соответственно иммобилизованные антигены или антитела вещества, содержащие группы, 31 выделяются при помощи носителей с группами, благодаря образованию дисульфидных связей S–S. Носителями в данном виде хроматографии служат силикаты, декстрины, целлюлоза и др. Разделение веществ выполняется следующим образом в колонку помещают носитель, к которому ковалентно присоединен афинный лиганд, например, ингибитор, специфический для выделяемого фермента. Через колонку пропускают раствор смеси белков, содержащий выделяемый белок-фермент, который связывается с ингибитором другие белки проходят колонку, не вступая нив какие взаимодействия с лигандом. Для снятия оставшегося на колонке выделяемого фермента колонку промывают раствором активного ингибитора этого фермента. Биоспецифической хроматографией выделяют специфические нуклеиновые кислоты, ферменты, рецепторы лекарственных препаратов, гормоны, вирусы, антитела, антигены, клетки. Этим методом можно выделять следовые (до нескольких мкг) количества биологически активных веществ. 3.3.5. Распределительная хроматография Распределительная хроматография основана на различии в распределении веществ между двумя несмешивающимися фазами — подвижной и неподвижной, нанесенной на твердый носитель. Скорость перемещения концентрационных зон разделяемых компонентов определяется их коэффициентами распределения. Примером распределительной хроматографии является хроматография на бумаге (бумажная хроматография. Бумажная распределительная хроматография. Этот вид хроматографии нашел широкое применение для анализа и идентификации микроскопических количеств веществ или их смесей (от 0.001 до 1 мкг. В бумажной хроматографии носителем неподвижной фазы является хроматографическая бумага, равной плотности и толщины и одинаковая по всем свойствам во всех направлениях. Хроматографическая бумага гигроскопична и содержит обычно доводы, которая и является неподвижной фазой. При проведении анализа смеси веществ каплю исследуемого раствора (1 – 10 мкл) и капли растворов "свидетелей" — веществ, присутствие которых в смеси предполагается, — наносят на край листа хроматографической бумаги на так называемую линию "старта. Край бумаги ниже стартовой линии опускают в подвижную фазу (органический растворитель или смесь растворителей, менее полярные, чем вода, помещенную в хроматографическую камеру. Под действием капиллярных сил растворитель движется вверх вдоль листа и * Когда к двухфазной жидкой системе добавляют какое-нибудь вещество, в общем случае оно распределяется между фазами с неодинаковыми равновесными концентрациями вещества в каждой фазе. Отношение концентраций вещества в двух фазах и есть коэффициент распределения. 32 захватывает разделяемые вещества, скорость перемещения которых зависит от коэффициентов распределения их между водой и органическим растворителем. После достаточного продвижения фронта растворителя бумагу вынимают из хроматографической камеры и высушивают. Если разделяемые вещества бесцветные, то хроматограмму проявляют, обрабатывая реактивом, образующим окрашенные соединения с анализируемыми веществами. При анализе состава смеси сопоставляют положение пятен "свидетелей" с положением пятен разделенных веществ и делают вывод о наличии или отсутствии в смеси тех или иных веществ. Рис. 3.6. Бумажная хроматограмма Положение пятен веществ на хроматограмме характеризуют фактором удерживания (R f ): Значение R f для данного соединения является характеристической величиной. Эти значения для большинства веществ приведены в специальных таблицах и могут применяться для идентификации. 3.4. Применение хроматографии в медицине Биоспецифическая хроматография применяется при изучении ферментативной активности, для удаления нежелательных белковых компонентов из крови, лимфы и плазмы при клинической детоксикации, например, при лечении различных иммунологических заболеваний, для чего в кровообращение больного включается колонка со специфическим иммуносорбентом. В фармакологии и фармации основное направление использования хроматографии — это идентификация лекарственных веществ, определение их чистоты, количества и состава примесей, количественное определение биологически активных компонентов в растительном сырье, в полупродуктах, в 33 сложных лекарственных смесях. Хроматография служит для контроля производства лекарств, для изучения стабильности лекарственных форм, для выбора метода оценки стабильности и т. д. Наибольшее значение хроматография приобрела в клинической фармакологии и фармакокинетике — для определения минимальных концентраций лекарств в биосредах организма и для исследования путей их метаболизма, что особенно важно в педиатрии и при лечении пожилых больных. Наконец, исключительно эффективно применение хроматографии при лечении психотропными препаратами, особенно при длительном применении, когда длительный прием их вызывает изменение метаболизма в зависимости от индивидуальных особенностей пациента и требуется дифференциированный подход к больному. Необходимо отметить, что исторически свое первое применение в медицине хроматография получила в судебной токсикологии, когда в 1955 году в Англии было раскрыто дело об убийстве детей путем введения им барбитуратов. Ни один из до тех пор известных методов определения отравляющих веществ не давал возможности быстрого и точного анализа примененного яда. И только использование бумажной хроматографии позволило решить эту проблему и закончить столетнюю историю поисков методов определения растительных алкалоидов и их синтетических аналогов. 3.5. Варианты вопросов из ада ч для самостоятельной работы Вариант 1 1. Укажите на каком доминирующем механизме разделения веществ основан каждый из указанных типов хроматографии 1) адсорбционная, 2) ионообменная, 3) молекулярно -ситовая а) различная способность к ионообменной адсорбции, б) различная степень специфичности связывания с неподвижной фазой, в) различная проницаемость в неподвижную фазу, г) различные коэффициенты распределения, д) различная способность к физической адсорбции. 2. Предложите наиболее эффективную методику хроматографического разделения веществ для а) очистки выделенной из биологической жидкости белковой смеси от примесей низкомолекулярных соединений и неорганических электролитов, применяемых для высаливания белков б) быстрой идентификации и определения чистоты лекарственных препаратов. 3. Теплота адсорбции (кДж/мо ль) галогенпроизводных углеводородов RHal на различных адсорбентах имеет следующие величины Адсорбент RF RCl RBr RI Al 2 O 3 6.89 7.64 8.40 8.40 силикагель (SiO 2 ) 5.46 5.54 5.54 5.38 34 а) Какой адсорбент необходимо применить для разделения методом колоночной адсорбционной (жидкостно-твердофазной) хроматографии смеси, состоящей из 1-бромгексана, 1-фторгексана и 1-иодгексана? б) В каком порядке будут выходить из колонки разделяемые компоненты смеси 4. Можно ли разделить методом ионообменной хроматографии следующие смеси а) гексанол-1, пентанол-2, 2-метилгексанол-2; б) D-глюкозамин, D-глюкуроновая кислота, D-маннаровая кислота Ответ обоснуйте, исходя из структуры разделяемых веществ. 5. При анализе смеси липидов методом тонкослойной хроматографии на силикагеле были получены следующие результаты длина пробега фронта растворителя l 0 = 200 мм, расстояния от середины пятен до линии старта l 1 = 132 мм, l 2 = 88 мм, l 3 = 31 мм. Пользуясь приведенными ниже значениями R f , определите, какие липиды обнаружены в смеси. В-во дистеарин диолеин холестерин церамид лецитин сфингомиелин кефалин R f 0.73 0.70 0.67 0.43 0.15 0.11 0.00 6. Ниже приведены времена удерживания (время от введения пробыв хроматограф до выхода максимума пикана хроматограмме, в мин) спиртов при определении их методом ГЖХ: метанол — 0.45, пропанол — 0.90, этанол — 0.62. Схематично изобразите хроматограмму этой смеси. 7. На рисунке изображена проявленная тонкослойная хроматограмма лекарственных препаратов ряда пенициллина, выполненная в варианте со "свидетелями. Какие вещества присутствуют в смеси Какие вещества не идентифицированы и можно ли их идентифицировать с помощью приведенных ниже значений R f для аналогичных условий анализа, если l 0 = 120 мм, l 1 = 85 мм, l 2 = 71.5 мм Вариант 2 1. Укажите на каком доминирующем механизме разделения веществ основан каждый из указанных типов хроматографии 35 1) распределительная, 2) биоспецифическая, 3) ионообменная а) различная растворимость соединений, образующихся при взаимодействии с осадителем в неподвижной фазе, б) различная степень специфичности связывания с неподвижной фазой, в) различная проницаемость в неподвижную фазу, г) различная способность к ионообменной адсорбции, д) различные коэффициенты распределения. 2. Предложите и обоснуйте наиболее эффективную методику хроматографического разделения веществ для а) выделения основных аминокислот из гидролизата белка, полученного при исследовании его аминокислотной последовательности б) выделения антител на специфический антиген при исследовании иммунологического статуса больного. 3. Теплота адсорбции (кДж/моль) карбоновых кислот и их производных на адсорбенте "флорисил" имеет следующие величины Вещество Теплота адсорбции Алифатические карбоновые кислоты 7.6 Ароматические карбоновые кислоты 6.1 Сложные эфиры карбоновых кислот 5.27 Амиды карбоновых кислот 9.6 Нитрилы ароматических карбоновых кислот 3.33 Определите, в каком порядке будут выходить из колонки разделяемые методом колоночной адсорбционной (жидкостно-твердофазной) хроматографии компоненты смеси, включающей в себя амид бутановой кислоты, этиловый эфир гексановой кислоты, бензойную кислоту, нитрил пара-метилбензойной кислоты, пентановую кислоту 4. При анализе смеси нуклеиновых оснований методом бумажной хроматографии были получены следующие результаты длина пробега фронта растворителя l 0 = 257 мм, расстояния от середины пятен до линии старта l 1 = 77 мм, l 2 = 94 мм, l 3 = 205 мм, l 4 = 184 мм. Пользуясь таблицей R f , определите, какие вещества обнаружены в смеси. В-во аденин аденозин гуанин гуанозин цитозин урацил уридин R f 0.30 0.53 0.37 0.58 0.80 0.72 0.81 5. Можно ли разделить методом ионообменной хроматографии следующие смеси а) фосфатидилсерин, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин; б) глюкоза, лактоза, сахароза Ответ обоснуйте, исходя из структуры разделяемых веществ. 6. Ниже приведены времена удерживания (время от введения пробыв хроматограф до выхода максимума пикана хроматограмме, в мин) углеводородов при определении их методом ГЖХ: бензол — 1.30, толуол — 3.80, гексан — 1.65. Схематично изобразите хроматограмму этой смеси. 36 7. На рисунке изображена бумажная хроматограмма, полученная при наркологической экспертизе, выполненная в варианте со "свидетелями. Какие вещества присутствуют в смеси Какие вещества не идентифицированы и можно ли их идентифицировать с помощью таблицы R f для аналогичных условий анализа, если l 0 = 125 мм, l 1 = 65 мм, l 2 = 87 мм Вариант 3 1. Укажите на каком доминирующем механизме разделения веществ основан каждый из указанных типов хроматографии 1) биоспецифическая, 2) адсорбционная, 3) распределительная а) различная способность к ионообменной адсорбции, б) различная степень специфичности связывания с неподвижной фазой, в) различная проницаемость в неподвижную фазу, г) различные коэффициенты распределения, д) различная способность к физической адсорбции. 2. Предложите и обоснуйте наиболее эффективную методику хроматографического разделения веществ для а) выделения нуклеиновых оснований из продуктов гидролиза специфической нуклеиновой кислоты, полученных при изучении ее нуклеотидной последовательности б) быстрого определения концентрации и типа фосфорорганического инсектицида, явившегося причиной бытового отравления больного. 3. Теплота адсорбции (кДж/моль) спиртов и карбонильных соединений на силикагеле имеет следующие величины Вещество Теплота адсорбции Одноатомные спирты 5.60 Фенолы 4.20 Алифатические альдегиды 4.97 Ароматические альдегиды 3.48 Алифатические кетоны 5.27 Ароматические кетоны 4.56 37 Определите, в каком порядке будут выходить из колонки разделяемые методом колоночной адсорбционной (жидкостно-твердофазной) хроматографии компоненты смеси, включающей в себя бутаналь, пентанол-1, крезол, диэтилкетон, бензальдегид, дифенилкетон? 4. При анализе смеси сахаров методом тонкослойной хроматографии на силикагеле были получены следующие результаты длина пробега фронта растворителя l 0 = 300 мм, расстояния от середины пятен до линии старта l 1 = 83 мм, l 2 = 149 мм, l 3 = 56 мм, l 4 = 76 мм. Пользуясь таблицей R f , определите, какие сахара обнаружены в смеси. В-во арабиноза ксилоза рибоза глюкоза галактоза манноза фруктоза R f 0.28 0.29 0.49 0.17 0.18 0.23 0.25 5. Можно ли разделить методом ионообменной хроматографии следующие смеси а) фенол, о-нитрофенол, п-метилфенол; б) ксилит, сорбит, маннит Ответ обоснуйте, исходя из структуры разделяемых веществ. 6. Ниже приведены времена удерживания (время от введения пробыв хроматограф до выхода максимума пикана хроматограмме, в мин) сложных эфиров при определении их методом ГЖХ: этилацетат — 2.0, метилформиат — 0.55, изо-пропилацетат — 3.65. Схематично изобразите хроматограмму этой смеси. 7. На рисунке изображена тонкослойная хроматограмма смеси аминокислот, выполненная в варианте со "свидетелями. Какие вещества присутствуют в смеси Какие вещества не идентифицированы и можно ли их идентифицировать с помощью таблицы R f для аналогичных условий анализа, если l 0 = 100 мм, l 1 = 19 мм, l 2 = 37 мм 4. ДИСПЕРСНЫЕ СИСТЕМЫ В широком смысле слова дисперсность присуща любому веществу на молекулярном, атомном, ядерном и т. д. уровне. В нашем курсе понятие дисперсности распространяется на широкую область размеров тел от несколько бóльших, чем простые молекулы, до видимых невооруженным глазом, те. от 10 –7 до 10 –2 см. 38 4.1. Классификация дисперсных систем. По агрегатному состоянию фаз Как и дисперсные системы вообще, коллоидные дисперсные системы состоят, как минимум, из двух фаз — дисперсной фазы и дисперсионной среды. Наиболее общая классификация дисперсных систем основана на различном агрегатном состоянии этих фаз, в соответствии с чем дисперсные системы делят на 8 типов (табл. 4.1). Для краткости их обозначают дробью, числитель которой указывает на агрегатное состояние дисперсной фазы, а знаменатель — дисперсионной среды. Таблица 4.1. Классификация дисперсных систем по агрегатному состоянию фаз. Дисперсная фаза Дисперсионная среда Условное обозначение Название системы и примеры Твердая Твердая Т/Т Твердые гетерогенные системы минералы, сплавы Жидкая ТЖ Суспензии и золи пульпы, взвеси, пасты, бактерии, золи металлов вводе Газовая Т/Г Аэрозоли пыли, дымы порошки Жидкая Твердая Ж/Т Капиллярные системы жидкость в пористых телах, адсорбенты в растворах, жемчуг, опал гели Жидкая Ж/Ж Эмульсии нефть, кремы, молоко Газовая Ж/Г Аэрозоли туманы, облака Газовая Твердая Г/Т Пористые тела твердые пены, адсорбенты в газах, гемостатические губки Жидкая Г/Ж Пены флотационные, противопожарные, мыльные Газовая — Не являются гетерогенными системами |