Федеральное агенство по здравоохранению и социальному развитию
 Скачать 1.05 Mb.
|
5.Лабораторная диагностикаИсследуемый материал - патологические выделения из половых органов. 1.Экспресс-диагностика непрямая РИФ. 2.Микроскопический метод. Гр.(-) или Гр. вариабельные мелкие палочки, колонизирующие клетки плоского эпителия, так называемые "ключевые" клетки. В этих клетках гарднереллы, расположенные вокруг ядра - Гр. (+), по периферии - Гр.(-). 3.Бактериологический метод Посев на среды с тиамином, рибофлавином, фолиевой кислотой, биотином, а также на кровяной агар // с человеческой и с бараньей кровью. Образуют калонии d-0,5мм, гладкие, круглые. На кровяном агаре -гемолиз (с человеческой, но не с бараньей кровью). Идентификация по биохимическим свойствам. Тесты на оксидазу и каталазу отрицательные (-). Образуют кислоту при расщеплении мальтозы (+), но не маннита(-). Выделение чистой культуры не рекомендуется, т.к. 58% женщин без бак.вагиноза имеют G.vaginalis во влагалищном секрете. 4. Проба с КОН 10%: На предметном стекле смешивают каплю 10%раствора КОН с выделениями из гениталий - появление запаха "тухлой рыбы" при заболевании (за счет образования аминов). 6.Специфическая профилактика и терапия. Отсутствуют. ДОМАШНЕЕ ЗАДАНИЕ К ЗАНЯТИЮ № 12
Практическое занятие №13 ДАТА ________________ Тема: Строение вирусных частиц. Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций. Цель занятия:
Практическая работа:
 среда 199 в исходном виде среда 199, изменившаяся в результате метаболизма клеток культуры ПОЯСНЕНИЯ К ЗАНЯТИЮ: Общие свойства вирусов. Вирусы – микроскопические неклеточные формы жизни, обладающие свойством генетического паразитизма, содержащие один тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) и размножающиеся путем дезинтеграции. Вирусы существуют в двух качественно разных формах: внеклеточной – вирион и внутриклеточной – вирус. Вирусы человека и животных, в основном, сферической формы, могут быть правильной многогранной формы. Вирусы растений, как правило, палочковидной формы, а вирусы бактерий (бактриофаги) чаще всего имеют форму сперматозоидов. Размеры вирусов колеблются от 20 до 300 нм. В зависимости от размеров вирусы делятся на:
Определенные связи с размером имеет структура и химический состав вируса. Наиболее просто устроены мелкие вирусы, наиболее сложно – крупные. Мелкие вирусы состоят только из нуклеиновой кислоты и белка – это нуклеопротеиды и нуклеокапсиды. Капсид состоит из белковых субъединиц – капсомеров, уложенных компактно, правильными образованиями на поверхности нуклеотида в виде спирали (миксовирусы) или по кубическому типу симметрии (энтеро-, адено-, герпесвирусы). Каждый вирус имеет определенное число капсомеров (адено – 252, полио – 60, герпес – 162 и т.д.). У средних и крупных вирусов, кроме нуклеокапсида, есть внешняя оболочка, содержащая белки, жиры, углеводы, - супрекапсид. Вся эта структура – вирион. В состав вириона входят неорганические ионы. Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций.
1-ый этап – накопление вирусов: а) в культурах клеток и тканей б) в куриных или утиных эмбрионах в) организме чувствительного лабораторного животного 2-ой этап – обнаружение (индикация) вирусов: а) в культуре клеток: по обнаружению цитоплазматических и внутриядерных включений, по ЦПД вируса, по цветной пробе Солка, по РГА и РГАдс. б) в курином эмбрионе: по образованию бляшек на поверхности ХАО, по помутнению амниотической жидкости, по РГА. в) в организме лабораторного животного: по клиническим и патологоанатомическим изменениям тканей и органов. 3-ий этап – идентификация вирусов: а) РТГА. б) РН с учетом по: цветной пробе Солка, РТГАдс, нейтрализации ЦПД или инфекционной активности вируса. в) РИФ, РСК.
Пояснения по методам лабораторной диагностики вирусных инфекций.
б) В клетках, пораженных некоторыми вирусами, можно наблюдать образование вирусных включений, локализующихся в цитоплазме (тельца Бабеша-Негри при бешенстве, тельца Гварниери при натуральной оспе), или в ядре (при инфекции, вызванной аденовирусами, герпесвирусами). Природа не всех вирусных внутриклеточных включений ясна. Тельца Бабеша-Негри при бешенстве, по данным японских ученых, являются местом продукции вирионов, т.е. колониями элементарных частиц. При герпесе включения на ранней стадии формирования представляют собой скопления вирионов. Включения окрашиваются по Романовскому-Гимзе, Туревичу, Муромцеву (при бешенстве).
а) ЭМ (электронная микроскопия) – позволяет обнаружить возбудителя в клиническом материале при негативном контрастировании. Этот метод требует достаточно высокой концентрации возбудителя в материале (104-105 частиц/мл). б) Обнаружение антигенов вирусов:
- РИА (радиоиммунный анализ), разновидность твердофазного иммунологического анализа, когда один из известных компонентов имеет радиоактивную метку. Результаты учитываются с помощью счетчика или авторадиографии, используя рентгеновскую пленку. Для выявления АГ исследуемый материал смешивают со специфической сывороткой, а затем через определенное время вносят гомологичный АГ, меченый радиоактивным изотопом. При этом между анигеном исследуемого материала и меченным антигеном возникает конкуренция за связывание со специфической сывороткой. Если меченый АГ остается свободным, реакция считается положительной, поскольку исследуемый АГ связался с диагностической сывороткой. Такой вариант иммуноанализа называется конкурентным.
1-ый этап – накопление вирусов:
Культуры тканей стали активно использоваться с 50-х годов, когда в практику вошли антибиотики (прекратились бактериальные проросты ткани), были разработаны синтетические питательные среды, а главным стимулом послужило выявление ЦПД у вирусов. С 1954 года стали использовать метод однослойных культур тканей. Существует 3 типа тканевых культур:
Первично-трипсинизированные культуры получают из различных тканей: кожно-мышечной ткани эмбрионов человека, куриных, мышиных, из почек различных эмбрионов, из легких, из роговицы глаза кролика и т. д. Ткань измельчают, обрабатывают трипсином, освобождают от детрита, стандартизуют число клеток, взвешенных в питательной среде с антибиотиками, разливают в пробирки или флаконы. Полуперевиваемые культуры – это культуры из диплоидных клеток, способные вне организма выдерживать 40-50 пассажей благодаря двойному набору хромосом, после чего отмирают. Перевиваемые культуры существуют вне организма очень долго. Они получены из нормальных тканей, из злокачественных, эмбриональных. Перевиваемые линии культур тканей: Нер-2 (злокачественные клетки из опухоли гортани человека), НеLа (злокачественные клетки из раковой опухоли шейки матки), Детройт-6 (злокачественные клетки из опухоли мозга), A-1 (клетки амниона человека), МК-2 – из почек обезьяны – всего около 400 видов. Для культур клеток необходимы питательные среды. Наиболее универсальная – 199 среда, содержащая 66 компонентов. Игл установил 28 крайне необходимых компонентов: глютамин, 12 незаменимых аминокислот, 8 витаминов комплекса В, 6 неорганических ионов, углевод, сыворотка. Основу всех сред составляют солевые растворы: Эрла, Хенкса. рН среды должна быть строго определена и постоянна – 7,0-7,4.
Эмбрионы для выделения вирусов применяют с 1930 года. Преимущества: это закрытая полость, свободная от микрофлоры и вирусов. У эмбрионов не образуются антитела, как в организме лабораторных животных, они доступны и дешевы. Используются эмбрионы разного возраста (от 5-7-дневного до 11-13-дневных) и разные методы заражения: в амнион, на хорион-аллантоисную оболочку – ХАО, в хорион-аллантоисную полость, в желточный мешок.
В основном используются белые мыши разного возраста, обезьяны (для вируса кори). При накоплении вирусов в организме животных можно оценить этапы развития клинической картины заболевания, патоморфологические и патогистологические изменения в органах и тканях. 2-ой этап – обнаружение (индикация) вирусов: а) В культуре ткани:
При размножении вируса в культуре ткани происходят различные изменения, которые в конечном итоге приводят к гибели клетки. Сморщивание клеток, пикноз ядер, скручивание их, образование небольших очагов этих изменений наблюдается при энтеровирусной инфекции, полиовирусы тоже дают очень быстро ЦПД. Вирус может размножаться и не вызывать заметных изменений в клетке, тогда прибегают к окрашиванию монослоя гематоксилин-эозином или другим гистохимическим методом и изучают тонкие изменения в ядрах и цитоплазме и т.д.
Данный способ индикации используется только для вирусов, содержащих гемагглютинины (ГА). Если к культуре клеток, зараженной вирусом с ГА, добавить эритроциты, то они могут адсорбироваться на клетках, пораженных вирусом. Данный феномен наблюдается с вирусами клещевого энцефалита, гриппа, парагриппа, кори, паротита и т. д. Учёт реакции проводится с помощью световой микроскопии.
Данный способ индикации используется только для вирусов, содержащих гемагглютинины (ГА). Вирусы, обладающие ГА, способны вызывать склеивание эритроцитов. В отличие от гемадсорбции, для РГА берется вируссодержащая жидкость (ВСЖ) (культуральная среда, амниотическая или аллантоисная жидкость и т.д.), помещается в лунку планшета и добавляется взвесь эритроцитов (куриных, бараньих, человеческих и др.). При наличии в ВСЖ вируса с ГА происходит агглютинация эритроцитов, и они образуют осадок в виде зонтика (РГА положительная); при отсутствии вируса образуется осадок из эритроцитов в виде пуговки (РГА отрицательная).
Самый простой метод индикации вирусов в культуре клеток. Сущность его заключается в визуальной оценке окраски питательной культуральной среды. Большинство питательных сред для культур тканей содержит индикатор – феноловый красный. В нейтральной стерильной среде индикатор имеет красный цвет. В кислой среде феноловый красный становится желтым. Жизнеспособные клетки выделяют в питательную среду кислые продукты своего метаболизма, вызывая изменение цвета индикатора с красного на желтый уже на третьи сутки. При накоплении вируса в культуре клеток он нарушает функционирование клеток вплоть до их гибели. При этом отмечается задержка изменения цвета среды более 6 дней, что и позволяет сделать заключение о присутствии вируса в культуре. б) В куриных эмбрионах:
в) В организме лабораторного животного:
3-ий этап – идентификация вирусов: Идентификация вируса производится по инактивации его или его свойств специфическими противовирусными сыворотками. Для этого вируссодержащую жидкость (в РТГА, РН, РСК, ИФА) или культуру инфицированных клеток (в РИФ) инкубируют с диагностическими сыворотками, после чего: а) РТГА:
б) РН с учетом по:
если вирус связался с антителами диагностической сыворотки, он не может инфицировать и разрушать клетки культуры, что приводит к пожелтению питательной среды (РН положительная). Если сыворотка не подходит к данному вирусу, он поражает клетки культуры, они погибают, и цвет питательной среды остается красным.
если вирус связался с антителами диагностической сыворотки, он не оказывает ЦПД на клетки культуры (РН положительная). Учет проводят микроскопически.
если вирус связался с антителами диагностической сыворотки, он не вызывает заболевание у инфицированного лабораторного животного (РН положительная).
если вирус связался с антителами дигностической сыворотки, он не вызывает адсорбции (фиксации) эритроцитов на поверхности культуры клеток (РН положительная). Учет проводят микроскопически. в) РСК г) ИФА можно использовать сэндвич-вариант постановки ИФА (см. экспресс-диагностику, только вместо исследуемого материала используют вируссодержащую жидкость). д) РИФ культуру клеток, инфицированных вирусом, обрабатывают дигностической люминесцирующей сывороткой и учитывают результат реакции с помощью люминесцентного микроскопа. Если вирус связывается с антителами диагностической сыворотки, наблюдается свечение клеток (РИФ положительна).
Для серодиагностики вирусных инфекций используют парные сыворотки, взятые с интервалом 10-14 дней. Диагностически значимым является не менее чем 4-х-кратное нарастание титра AT.
|