Издательский дом Питер
 Скачать 5.79 Mb.
|
|
15.4. Полимеразная цепная реакция в диагностике гемотрансмиссивных инфекций В настоящее время наиболее совершенным диагностическим методом, позволяющим выявить нуклеиновые кислоты возбудителей инфекционных заболеваний, является Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Она дает возможность за счет быстрого многократного увеличения количества копий тестируемых специфических последовательностей нуклеиновых кислот обнаруживать патогенные вирусы даже в тех случаях, когда другими способами их выявить невозможно. Это преимущество достигается за счет высокой чувствительности ПЦР-систем, которая составляет около 10 клеток или вирусных частиц, в то время как для других методов необходимо 103-106. ПЦР-диагностикумы, в отличие от иммунологических тест-систем позволяют избежать проблем перекрестной реактивности, обеспечивая высокую специфичность. ПЦР находит применение для контроля эффективности методов инактивации в препаратах крови и для лабораторной апробации донорской крови, ее компонентов и препаратов в качестве метода арбитражного анализа. Микробная контаминация продуктов крови при заготовке и хранении компонентов в банках крови является одной из наиболее серьезных проблем, встречающихся в учреждениях службы крови. Вирусологическое исследование крови в практических учреждениях службы крови основывается на определении антивирусных антител или белков вируса с помощью иммунофер-ментного анализа, иммуноблотинга, а к их основным недостаткам относится сложность определения гемотрансмиссивных вирусов в начальный/сероне-гативный период инфекции. Известно, что длительность серонегативного периода и остаточный риск посттрансфузионных вирусных инфекций связаны между собой (табл. 157). Для создания надежной технологии ПЦР-тестирования плазмы доноров были получены данные о реальной концентрации вирусов гепатита В, С и ВИЧ в серонегативный период. Они составили: — ВГВ — 103 геном-эквивалентов в мл; 712 Глава 15. Гемотрансмиссивные инфекции и их профилактика Таблица 157 Остаточный риск посттрансфузионных вирусных инфекций в США [Lee H. H., Allain J.-P., 1998]
— ВИЧ — 107 геном-эквивалентов в мл; — ВГС — 108 геном-эквивалентов в мл. Широкий спектр существующих гемотрансмиссивных агентов требует использования разнообразных молекулярных методов в различных клинических ситуациях. Так, стратегия исследования в значительной степени определяется составом вирусного генома, например геном ретровируса ВИЧ представлен двунитевой РНК, которая не может быть прямо амплифицирована с помощью ПЦР. Однако ВИЧ-инфицированные лимфоциты содержат прови-русную ДНК, и определение этой ДНК как мишени позволяет определять ВИЧ-инфекцию. Совершенно другая стратегия используется для детекции вируса гепатита С (ВГС), так как для последнего определены как минимум 12 субтипов. Геном ВГС, представляющий собой линейную молекулу РНК, не интегрируется стабильно в геном клетки, хотя он присутствует в виде кле-точно-ассоциированной РНК в инфицированых гепатоцитах. Этот факт определяет необходимость различной скрининговой стратегии: РНК ВГС определяется при выполнении модифицированной РТ-ПЦР (РТ — от reversetranscriotion; обратная транскрипция) путем получения промежуточной ДНК на матрице РНК ВГС, выделенной из плазмы крови. Другой тип анализа (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов, ПДРФ) амплифи-цированной РНК осуществляется для определения субтипов ЦМВ. Вероятно, детекция вирусов с помощью ПЦР будет особенно перспективна в тех случаях, когда необходимо проведение множественной ПЦР для определения ДНК/кДНК различных вирусов, так как этот множественный тест может быть выполнен в одной реакции, что значительно повышает экономическую эффективность исследования. Технологии выявления нуклеиновых кислот (nucleic acid amplification techniques, NAT) вирусов внедряются в практику обследования доноров. В Германии с 1997 г. обследовано более 10 млн доноров. Встречаемость только NAT-позитивных лиц на 1 млн доноров: ВИЧ-1 - 0,09, ВГС - 0,86, ВГВ — 0,63 [Seirfried E. et al., 2001]. В Японии (обследовано более 7 млн образцов) эти величины составляют: ВИЧ-1 - 0,42, ВГС - 2,08, ВГВ - 14,42. Полимеразная цепная реакция___________________________713 V. Lindecker и соавт. (2001) отмечают недостаточную точность исследования РНК ВГС в ряде французских лабораторий и необходимость участия в национальной системе внешнего контроля качества исследований. С 1 июля 2001 г. во Франции введено обязательное исследования РНК ВГС и ВИЧ-1 у доноров. Разработана система для одновременного выявления РНК ВГС и ВИЧ-1 (Chiron Corp., США). С ее использованием 1 лаборант в течение 5-6 ч может выполнить обследование 182 образцов [Gonzalez R. et al., 2001]. Адекватной считают технологию NAT, при которой пулирование образцов, экстракция и амплификация должны происходить в едином автоматизированном процессе [Roth W. К., Seifried E., 2001]. С. L. Van der Poel (2001) полагает, что NAT может повысить безопасность продуктов крови, но их стоимость существенно возрастет. Учитывая ограниченность ресурсов здравоохранения, до внедрения этой технологии в практику службы крови нужно провести сравнительную оценку затрат и эффективности. В настоящее время S. Loubiere и соавт. (2001) считают выполне-,ние ПЦР-скрининга РНК ВГС у доноров во Франции весьма экономически неэффективным. Диагностика гепатита В Вирус гепатита В относится к семейству гепаднавирусов. Принято считать, что «полные» частицы Дейна с первоначальным названием «австралийский антиген», которые представлены двойной оболочкой, ядром с двунитча-той вирусспецифической циркулярной ДНК и ДНК-полимеразой, являются полноценным вирусом гепатита В (HBV). Традиционным методом обнаружения текущей инфекции является детекция поверхностного антигена вируса — HBsAg, сердцевинного антигена — HBcAg и антител класса IgM к антигену НВс иммуноферментным методом. Применение метода ПЦР с использованием праймеров, специфичных для вирусной ДНК, при скрининге донорской крови позволяет выявить хронических носителей вируса гепатита В и лиц с первичной инфекцией до развития клинических симптомов. Выявление вирусных частиц у больных гепатитом наравне с определением спектра антител позволяет установить фазу и активность инфекционного процесса и проводить контроль эффективности лечения. Кроме того, иногда использование результатов ПЦР-анализа позволяет исключить диагноз гепатита В при клинических симптомах неясной этиологии. Результаты исследований А. В. Сычева и соавт. (1999) убедительно свидетельствуют о том, что в службе крови метод ПЦР на ДНК ВГВ пока не может рассматриваться как альтернатива методу ИФА для обнаружения HBsAg; только у трети доноров с наличием HBsAg в крови выявлена ДНК ВГВ. Вместе с тем не вызывает сомнения высокая диагностическая значимость ПЦР на ДНК ВГВ для расшифровки этиологии, верификации диагноза и диагностического мониторинга лечения. 714__________Глава 15. Гемотрансмиссивные инфекции и их профилактика Диагностика гепатита С Вирус гепатита С относится к семейству флавивирусов и представлен одной цепочкой РНК в липидорастворимой оболочке. Гепатит С относится к самым распространенным видам посттрансфузионного гепатита. Так как при циклическом течении гепатита С антитела выявляются редко, а обнаруживаются более стабильно при переходе болезни в хроническую стадию, диагностика гепатита С методом ПЦР приобретает особую актуальность. Более того, большинство современных диагностикумов рассчитаны в лучшем случае на выявление антител к смеси антигенных детерминант белков вируса, что не позволяет установить время и форму развития инфекционного процесса, а также провести адекватное лечение при его необходимости. И если в случае гепатита В ПЦР хорошо проводить в качестве референс-метода при установлении диагноза и для оценки антивирусной терапии, то выявление вируса гепатита С методом ПЦР служит ключевым доказательством активного течения вирусного процесса или его хронизации. Исследование РНК ВГС в пуле плазмы — обязательный (по Европейским правилам с июля 1999 г.) этап производства препаратов крови (после случаев инфицирования внутривенным иммуноглобулином). Проблемы контроля качества ПЦР Недостатки метода ПЦР, мешающие его широкому внедрению в практику обследования доноров, являются продолжением его достоинств. С одной стороны, чрезвычайно серьезна проблема контаминации. Любое нарушение прецизионности лабораторной технологии может с легкостью привести к попаданию микрочастиц материала, содержащего нуклеиновые кислоты возбудителей, в интактные образцы с последующим ложноположительным результатом исследования. Также не исключено и резкое снижение чувствительности исследования, связанное как с неправильным отбором, хранением и подготовкой биологического материала, так и с погрешностями проведения реакции и принципиальным несоответствием праймера молекулярной структуре генома возбудителя, что в конечном итоге обусловливает ложноотрицательный результат. Аналогично программам контроля качества для иммуноферментного анализа (см. раздел 15.3.2.), для оценки чувствительности и специфичности ПЦР-диагностикумов созданы специальные панели контроля качества применяемых наборов. На сегодняшний день наиболее презентабельной (с точки зрения разнообразия и качества предлагаемых панелей) является международная программа по контролю качества вирусных инфекций VQC. В частности, в программе контроля исследования ДНК ВГВ в 1997 г. участвовали 60 лабораторий, в том числе ПЦР-лаборатория Медицинского Центра «Авиценна» (Москва), использующая в работе отечественный набор («Авиценна-HBV скрин™ ПЦР-тест» ТУ 9398-407-00899696-96). Обобщенные результаты по данным 47 лабораторий выглядят следующим образом: Распространенность маркеров гемотрансмиссивных инфекций у доноров 715 — правильно определены положительные образцы — 100 %; — правильно определены отрицательные образцы — 88 %; — правильно определены VQC разведения — 100 %; — правильно определены EUROHEP разведения — 76 %; — правильно определены все образцы — 63%, Такие результаты позволяют констатировать лишь возможную перспективу внедрения ПЦР в рутинную практику обследования доноров гемоком-понентов. Тем не менее, приятно отметить, что результаты ПЦР-лаборатории МЦ «Авиценна» с использованием отечественных наборов были выше среднестатистических [Беглова С. М. и соавт., 1999]. Обращает на себя внимание 100 % совпадение результатов при идентификации отрицательных образцов и значительное повышение информативности наборов при идентификации положительных разведении: минимальное идентифицируемое разведение в 2000 г. составило 300 геном-эквивалентов в мл (результаты контроля представлены на сайте www.vqc.nl), что в 2,5 раза меньше реальной минимальной концентрации вирусов гепатита В в серонегативный период [Rogers P. et al.,1997]. Для других патогенов чувствительность наборов «Авиценна» в 2000 г. составила: — РНК ВГС — 3800 геном-эквивалентов в мл; — ДНК ЦМВ — 100 геном-эквивалентов в мл; — ДНК вируса простого герпеса 1-го типа — 1000 геном-эквивалентов в мл; — ДНК вируса простого герпеса 2-го типа — 1000 геном-эквивалентов в мл; — ДНК Chlamydiatrachomatis— 10 000 геном-эквивалентов в мл. По-видимому, при характеристике тест-систем чувствительность следует указывать не в абстрактных процентах, а в точных количественных единицах сравнения с признанным национальным или международным стандартным образцом. 15.5. Распространенность маркеров гемотрансмиссивных инфекций у доноров Обязательное обследование доноров гемокомпонентов включает исследование в донорской крови 4 специфических маркеров гемотрансмиссивных инфекций (анти-ВИЧ-1/2, HBsAg, анти-ВГС, анти-БТ) и одного суррогатного — активности сывороточной АЛТ. С 1993 г. обследовали около 100 тыс. 716 Глава 15. Гемотрансмиссивные инфекции и их профилактика потенциальных доноров гемокомпонентов, более 80 % из которых составили мужчины в возрасте 18-23 лет. Для исследований в основном использовали наиболее чувствительные диагностические тест-системы для иммунофермент-ного анализа, упомянутые в настоящей главе. Распространенность маркеров гемотрансмиссивных инфекций у обследованных доноров представлена в табл. 158 и 159 и в целом несколько ниже данных популяционных исследований по северо-западному и центральному регионам России. Подобная закономерность характерна для донорского контингента, проходящего предварительный врачебный отбор. Распространенность маркеров гемотрансмиссивных инфекций среди лиц с противопоказаниями к донорству существенно выше, поэтому пользоваться донорским контингентом в качестве контрольного следует с известными оговорками. В течение указанного периода в Военно-медицинской академии не выявлено случаев посттрансфузионных инфекционных осложнений, что также свидетельствует об адекватности и эффективности проведенного обследования доноров крови и ее компонентов. На фоне стабильности и тенденции к сокращению ин-фицированности ВГВ обращает на себя внимание увеличение доли анти-ВГС-позитивных лиц — признак роста распространенности скрытых форм этой инфекции [Бельгеев Н. В., 2001]. Увеличение контингента иммунокомпрометированных реципиентов гемокомпонентов требует обратить особое внимание на профилактику более широкого спектра инфекций, в первую очередь — цитомегаловирусной. Поскольку в широкой практике отечественной трансфузиологии лишь только начинают внедряться лейкоцитарные фильтры, актуальной остается задача профилактики гемотрансмиссивного токсоплазмоза (токсоплазма — облигатный внутрилейкоцитарный паразит). С использованием иммуноферментной тест-системы «ImmunoComb» (Франция) оценили распространенность антител класса IgG к цитомегаловирусу и токсоплазме у доноров различных групп Таблица 158 Распространенность маркеров гемотрансмиссивных инфекций у доноров
Примечание. БТ — бледная трепонема; m — количество инфицированных доноров в группе. * Впервые выявлены в 2000 г. Таблица 159 Распространенность маркеров гемотрансмиссивных инфекций у доноров
Примечание. БТ — бледная трепонема. В каждой колонке левый столбик цифр означает абсолютное количество доноров, правый — количество доноров в процентах. * Данные за 9 мес 2001 г. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||