Ответы по фтизиатрии История развития учения о туберкулезе
 Скачать 1.85 Mb.
|
|
12.Аллергии при туберкулезе виды аллергии клиническое значение При тбк аллергия возникает медленно в результате взаимодействия тбк с AT. Как положительное, так и отрицательное действие аллергии: положительное — ограничение инфекции, отрицательное - при выраженной аллергии ткани могут сами раздражаться (и тбк развивается быстро), аллергические реакции вызываются туберкулином- поствакцинальпая. 13. Пагологоанатомические и патоморфологические проявления туберкулеза органов дыхания Строение туберкулезной гранулемы Морфология: В течение первых нескольких часов от момента имплантации возникает экссудативный этап воспаления, в таком первичном очаге на периферии находятся нейтрофилы, моноциты, эозинофилы, тучные клетки, освобождающие БАВ. После появляются макрофаги и гистиоциты, которые дифференцируются и образуют клетки пластинчатого типа (эпителиоидные клетки), их число в течение 1-ой недели увеличивается. В течение 2-ой недели из макрофагов и эпителиоидных клеток образуются гигантские клетки (Пирогова - Ланхганса). Г игантские клетки (высокая фагоцитарная способность) располагаются в центре, затем слой эпителиоидных клеточных элементов. С 3-ей недели клетки, расположенные в центре, начинают погибать (казеозный некроз). Последнее связывают с накоплением антигенов и продуктов жизнедеятельности микобактерий. В начале 2-го месяца увеличивается количество лимфоцитов, которые образуют 3-ий слой тбк, гранулемы (анатомический заслон от дальнейшей тбк. экспансии), с этого момента становится положительной реакция на туберкулин. 3-ий месяц - перифокальное воспаление (увеличивается диаметр сосудов, отечность ткани), к концу 3-го месяца тбк. воспаление организуется в бугорки. Тбк. гранулема: субмиллиарная (при острой диссиминации), миллиарная (чаще при острой диссиминации), солитарные образования, конгломератные образования. Пути развития гранулемы: 1. Прогрессирование гранулемы гнойное расплавление очага, накопление в гранулеме AT, действие медиаторов, происходит разрушение вещества и на месте тбк процесса возникает тбк каверна. 2. При небольших тбк поражениях ткань может регенерировать (особенно в случаях сочетанного поражения: в одном органе прогрессирование, в другом регенерация). Отдаленные последствия опасны: в период полового созревания; в период беременности: в период воспалительного заболевания, потому что во всех случаях могут возникнуть отсевы тбк в другие органы. На их месте образуются инкапсулированные очаги (постпервичные очаги) - очаги Ашоффа, Пуля, Абрикосова. L-формы этих очагов через некоторое время начинают распространяться - повторно развивающийся тбк процесс (15-20%). Патофизиология: три фазы развития процесса: 1.Латентного микробизма (предаллергический период) - длительность 3-5 недель; бактериемия, бурное размножение, рассеивание тбк, в л/у и л/тк неспецифические изменения не выражены. Вырабатываются AT, клинически не проявляется. Течение тбк может остановиться. 2.Фаза иммунного ответа (фаза первичного тбк ответа с параспецифическими изменениями) - рассеян тбк.. возникновение положительной реакции на туберкулин, различные параспецифические реакции - воспалительные, аллергические изменения в организме в виде гистио- и лимфоцитарных инфильтратов, состоящих из МФ-реакций неспецифического воспаления и казеозного некроза. Развивается в лимфоузлах, лимфоидной ткани, коже, около сосудов. Могут быть очаговые и диффузные. Клиника: увеличение лимфоузлов, печени, селезенки. Блефарит, коньюктивит, васкулиты. 3. Фаза локальных изменений - в одном из органов в бугорках развивается некроз (легкие, л/у, опорно- двигательная система) - все бугорки в других органах исчезают. Активный тбк. - процесс с некрозом. При регрессе процесса казеоз уплотняется, проникают соли Са, образуются очаги, вокруг которых фиброзная капсула 14 Патоморфоз туберкулеза. Виды патоморфоза Патоморфоз А.Факторы влияющие: 1.окружающая среда, 2.характер питания, 3.сопутствующая патология, 4.старший возраст, 5.лекарственные средства, 6.социальный статус. Б. Существует два вида пагоморфоза: мнимый(ложный), истинный. Истинный: Изменение морфологической и клинической картины тбк. бусловленное приходящими факторами: тбк. + сахарный диабет; тбк. + хронический алкоголизм. Действительное и стойкое изменение клиники болезни бывает: -естественное: изменение картины болезни в процессе эволюции (изменение окружающей среды, изменение иммунного ответа).. - индуцированный - терапевтически обусловленный патоморфоз, генетически не детерминирован. С.Проявления;2у появление скрытых (стертых, атипичных) форм, более выражен фиброз, более быстрое разрешение фиброза, У увеличение компонента неспецифического воспаления вокруг гранулем (напоминает активную пневмонию), .^тенденция к инкапсуляции - образованию туберкуломы,^часто проявляются остаточные изменения, частые рецидивы, на фоне остаточных изменений часта реактивация тбк.^ изменилась частота причин смерти у больных в пожилом и старческом возрасте. 13 Пути заражения туберкулезом Роль контакта с больными туберкулезом Пути попадания: Аэрогенный: воздушно-капельный и пылевой - 92-95% Алиментарный: 5-6% ( через молоко и молочные продукты) J Внутриутробный ( через кровь, плаценту ) ."„' Контактный: через пораженную кожу, слизистые. До появления ПТП один больной-бактериовыделитель инфицировал, по данным литературы. 20 человек за 2 года. Есть данные о том .что МБ'Г инфицируются от V* до Уг лиц , тесно и достаточно длительно контактировавших с бактериовыделителями. Заболевают туберкулезом только 5-10% инфицированных людей. 16. Патогенез первичного туберкулеза. Его особенности в современных эпидемиологических условиях. Первичный туберкулез всегда вовлекает в патологический процесс лимфатическую систему. Частичный или тотальный казеозный некроз лимфатических узлов — важнейшая черта первичного туберкулеза. Наличие обширной перифокальной воспалительной реакции вокруг основного очага — также важная отличительная особенность первичного туберкулеза. При легочном поражении первичный легочный аффект обычно локализован в хорошо вентилируемых отделах, т. е. в средних и нижних долях легкого. В результате бактериемии, характерной для первичного периода туберкулезной инфекции, в легких и других органах формируются гематогенные очаги-отсевы. Нередко возникают распространенные параспецифические реакции. Остаточные посттуберкулезные изменения при первичном туберкулезе формируются медленно. Они постепенно обызвесгвляются, иногда подвергаются оссификации. 17.Патогенез вторичных форм туберкулеза. Роль экзогенной и эндогенной инфекции в развитии вторичных форм туберкулеза. Вторичный туберкулез развивается на фоне сформировавшихся в процессе первичного периода туберкулезной инфекции остаточных туберкулезных изменений (кальцинированные лимфатические узлы и очаги во внутренних органах). При вторичном туберкулезе специфический воспалительный процесс возникает на фоне ослабленного противотуберкулезного иммунитета. В связи с этим наклонность к генерализации патологического процесса отсутствует. Регионарные лимфатические узлы в патологический процесс не вовлекаются. Туберкулезное поражение обычно имеет органный характер с образованием очага, инфильтрата, каверны. В развитии вторичного туберкулеза большое значение имеет бронхогенный путь распространения МВТ. В большинстве случаев вторичный туберкулез поражает легкое, в основном верхние и задние его отделы. В сформировавшихся в исходе вторичного туберкулеза остаточных изменениях обычно отсутствуют признаки кальцинации или оссификации. 18. Современные методы обследования больного туберкулезом. Диагностический минимум обследования больного туберкулезом.(ОДМ) ОДМ (обязательный диагностический минимум при обследовании лиц с патологией органов дыхания): 1 .Целенаправленно собранный анамнез. 2. Стетоакустическое исследование органов дыхания. 3.Рентгенологическое исследование органов дыхания (крупнокадровая флюорография, обзорная рентгенография органов грудной клетки, компьютерная рентгенограмма). 4.Общий анализ крови. 5.Общий анализ мочи. 6.Исследование мокроты (промывных вод бронхов) на МБТ (3-х кратная бактериоскопия). 7.Проба Манту с 2ТЕ ППД- Л 19. Инструментальные методы обследования и их роль в диагностике и дифференциальной диагностике туберкулеза. Инструментальные методы диагностические оперативные вмешательства (инвазивные): 1. Диагностическая бронхоскопия. 2. Транс торакальная аспирационная биопсия легкого. 3. Пункция периферического лимфатического узла. 4. Плевральная пункция. 5. Бронхография. 6. Плевроскопия. 7. Видеоторакоскопия с биопсией. 8. Биопсия прескаленой клетчатки. 9. Медиастинотомия. 10. Открытая биопсия легкого. 20. Лабораторные методы выявления микобактерий туберкулеза Методы обследования на МБТ МЕТОДЫ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА Бактериологическая лаборатория играет существенную роль в выявлении, диагностике туберкулеза, выборе рациональных схем химиотерапии и оценке их эффективности. Бактериологическая диагностика включает обработку клинического материала, микроскопическое исследование, выделение микроорганизма с применением культуральных методов, идентификацию микобактерий с использованием бактериологических и биохимических гестов, а также определение лекарственной чувствительности микобактерий. Существует несколько групп методов, используемых для выявления МБТ в различном диагностическом материале: рутинные (микроскопия, культуральное исследование), биологические (биопроба, определение вирулентности штаммов МБТ). автоматические системы (MGIT, ВАСТЕС, МВ/ВасТ, ESP Culture System и др.), молекулярной генетические методики (PCR. I.CR, NASBA, Q-Bela и др.). Каждый из этих методов обладает определенной чувствительностью и специфичностью, что необходимо учитывать при клинической интерпретации полученных результатов. Бактериоскопическое исследование. Бактериоскопическое исследование мокроты с окраской мазка по Цилю-Нильсену для выявления кислотоустойчивых микобактерий (КУБ) является наиболее быстрым, доступным и экономически эффективным из существующих методов выявления больных туберкулезом. Оно может быть осуществлено в любой клинико- диагностической лаборатории (КДЛ) лечебно-профилактических учреждений всех уровней и ведомств. Бактериоскопия мокроты представляется чрезвычайно информативной для выяснения эпидемиологической опасности пациента для окружающих, которая коррелирует с числом микобактерий в образце. Бактериоскопическое исследование, проведенное должным образом, имеет положительную прогностическую ценность для легочного туберкулеза, более 90%. Разрешающая способность данного метода составляет 50-100 тыс. микобактерий в 1 миллилитре мокроты и существенно зависит от ряда факторов: правильности сбора мокроты, подготовленности лабораторного персонала и разрешающей способности используемых микроскопов. При микроскопии мазков, приготовленных из проб, взятых в течение трех последовательных дней, результативность метода повышается на 20-30%. Однако нет необходимости использовать более 4-5 проб мокроты. Метод окраски по Цилю-Нильсену наиболее часто используется при бакгериоскопичсском выявлении микобактерий. Он заключается в следующем: мазки мокроты окрашивают фуксином при нагревании, затем обесцвечивают солянокислым спиртом и докрашивают метиленовым синим. В результате микобактерий окрашиваются в малиновый цвет, а фон — в синий. Это специфическое окрашивание обусловлено способностью микобактерий удерживать краситель при обработке кислотой или спиртом. В бактериологических лабораториях, выполняющих большое количество исследований (100 и более ежедневно), используется люминесцентная микроскопия. Данный метод основан на способности липидов микобактрий воспринимать люминесцентные красители (акридиновый оранжевый, аурамин, родамин и др.) и затем светиться при облучении их ультрафиолетовыми лучами. В зависимости от красителей, микобактерий туберкулеза дают четкое ярко-красное свечение на зеленом фоне или золотисто-желтое - на темно-зеленом фоне. Метод люминесцентной микроскопии обладает большей чувствительностью, чем световая микроскопия, особенно в сочетании с методом обогащения диагностического материала (микроскопия осадка), поскольку люминесцентная микроскопия позволяет обнаружить измененные микобактерий, утратившие кислотоуетойчивость. в связи с чем они не выявляются при бактериоскопии по Цилю-Нильсену. Мазки для люминесцентной микроскопии готовят из осадка, полученного после обработки диагностического материапа детергентом с последующим отмыванием либо нейтрализацией. При положительном результате бактериоскопии мазков, окрашенных флуорохромами, должна быт ь проведена подтверждающая микроскопия мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену Бактериоскопическое исследование необходимо проводить очень тщательно. Обычно образец исследуют в течение 15 минут (что соответствует просмотру 300 полей зрения), чтобы сделать заключение об отсутствии или наличии КУБ в препарате. При окрашивании флюорохромами для исследования одного мазка требуется меньше времени. Основным диагностическим материалом для бактериоскопии на КУБ служит мокрота. Результаты бактериоскопического исследования на КУБ других биологических материалов (различных жидкостей, тканей, гноя, мочи и т.д.) имеют ограниченное значение для диагностики туберкулеза. Так. исследование мазков из осадка центрифугированной мочи не всегда позволяет получить достоверные результаты, поскольку в моче могут присутствовать нетуберкулезные микобактерий. Поэтому выявление КУБ в моче не всегда свидетельствует о наличии специфического процесса. В мазках из осадка промывных вод желудка и других материалов могут обнаруживаться кислотоустойчивые са-профиты, которые легко спутать с МВТ. Результат микроскопического исследования позволяет сделать заключение только о наличии или отсутствии в препарате кислотоустойчивых бактерий. Достоверно диагноз «туберкулез» можно установить только после выделения из клинического материала культуры МБТ с помощью культурального метода и ее идентификации. Отрицательный результат бактериоскоскопического исследования не исключает диагноз «туберкулез», так как в мокроте некоторых пациентов может содержаться меньше микобактерий, чем позволяет выявить бактериоскопия. Количество обнаруженных КУБ определяет степень тяжести заболевания и опасности больного для окружающих. Следовательно, исследование должно быть не только качественным, но и количественным. В современных эпидемиологических и экономических условиях бактериоскопическое исследование мокроты у обратившихся в ЛПУ за врачебной помощью лиц с клиническими симптомами, подозрительными на туберкулез, является приоритетным направлением в тактике раннего выявления данного заболевания. Возрастание роли этого метода связано также с возникновением в последние годы остропрогрессирующих форм заболевания, сопровождающихся выраженными клиническими проявлениями и обильным Культуральное (бактериологическое) исследование. Начиная со времени проведения работ Коха и до 1924 г. усилия ученых, направленные на поиски методов выделения чистых культур микобактерий туберкулеза, не имели особых успехов. В 1924 г. Левенштейн и Сумиоши установили, что кислоты и щелочи в известных концентрациях и при определенных экспозициях убивают сопутствующую микрофлору, не влияя на жизнеспособность МБТ. Этот метод при непрерывном совершенствовании стал приобретать практическое значение. В настоящее время бактериологическое (культуральное) исследование биологического материала на МБТ благодаря его высокой чувствительности (от 10 до 100 жизнеспособных микробных клеток в 1 мл исследуемого материала) и специфичности в сочетании с микроскопическим методом является «золотым стандартом» в диагностике туберкулеза. Бактериологическое исследование на туберкулез выполняется в специализированных бактериологических лабораториях противотуберкулезных диспансеров или посевных пунктах. Материал для бактериологического исследования собирают асептически. Перед проведением бактериологического исследования поступившие в лабораторию пробы обрабатывают растворами кислот или щелочей с последующим центрифугированием. Это необходимо дня разжижения и концентрации образца, а также для предотвращения контаминации, поскольку пробы мокроты вязкие по консистенции и содержат большое количество микрофлоры. Около 1 мл разжиженного и деконтаминированного клинического образца засевают в пробирки со средой и инкубируют при 37°С в течение 10 недель. Для культивирования микобактерий используют плотные (яичные, агаровые) и жидкие питательные среды. Яичные среды содержа! цельные яйца или яичный желток, а также фосфолипидьг, белки и другие ингредиенты. С целью предотвращения контаминации к среде добавляют некоторые красители, например, малахитовый зеленый, а также антибиотики. Поэтому яичные среды (Левеншейна-Йенсена, Финна), на которых культивируют микобактерий. имеют сине-зеленый цвет. Использование яичных сред позволяет получить видимый рост колоний М tuberculosis через 18-24 дня в виде сухого морщинистого налета кремового цвета. Однако качество ингредиентов, из которых готовится среда, иногда значительно варьирует, что может влиять на воспроизводимость результатов. По сравнению с яичными агаровые среды имеют ряд преимуществ: они готовятся из полусинтетических основ, что обеспечивает более стабильное качество и воспроизводимость результатов. Детекция роста МБТ на агаровых средах возможна через 10-14 дней. Однако агаровые среды дороже, требуют присутствия СО2 в атмосфере и инкубируются в термостате не более 1 месяца.. Как правило для выделения микобактерий используется набор из двух разных питательных сред. Автоматические системы. Разработка радиометрической системы ВАСТЕС 460 (Becton Dickinson) ознаменована собой качественный прорыв в быстрой детекции микобактерий и определении их лекарственной чувствительности Автоматические системы, предназначенные для выявления микобактерий туберкулеза, позволяют проводить детекцию роста микобактерий в 2-3 раза быстрее, чем классические методы. Положительный результат анализа должен обязательно подтверждаться бактериоскопически. В практике бактериологических лабораторий исследование с использованием автоматических систем обязательно проводится параллельно с исследованием на плотных питательных средах Идентификации микобактерий. Несмотря на то, что морфология колоний, наличие пигмента и ростовые характеристики дают некоторое представление о выделенном штамме микобактерий, для установления их видовой принадлежности микобактерий используют комплекс специальных лабораторных тестов. В 1970-х гг. Международной рабочей группой по таксономии микобактерий была стандартизована серия высоко воспроизводимых биохимических гестов, которые не требуют сложного технического обеспечения и могут быть проведены за несколько часов или дней. Это способность штамма микобактерий синтезировать никотиновую кислоту, восстанавливать нитраты, продуцировать уреазу, проявлять различную резистентность к антибиотикам, а также каталазная активность и термостабильность каталазы штамма МБТ. Кроме этого, для идентификации микобактерий используется набор бактериологических тестов: скорость роста на питательных средах, способность микобактерий образовывать корд-фактор, пигмент, расти на яичной или простой агаровой среде при разных температурных режимах; на средах, содержащих NaCl, пара-нитробензойную кислоту или салициловокислый натрий. Методы определения лекарственной чувствительности микобактерий. В лабораторной практике используют три основных метода определения лекарственной чувствительности микобактерий: метод абсолютных концентраций; метод соотношения резистентности; метод пропорций. Метод абсолютных (предельных) концентрации заключается в следующем. Микобактерий выращивают на питательных средах, содержащих противотуберкулезные препараты (ПТП) в различных концентрациях. Определение лекарственной чувствительности МБТ может быть прямым (посев на среды с противотуберкулезными препаратами патологического материала) и непрямым (посев на среды с противотуберкулезными препаратами выделенных культур микобактерий). Прямой способ позволяет значительно ускорить процесс получения результата, но им можно пользоваться только тогда, когда микобактерий обнаруживаются в исследуемом материале бакгериоскопически и содержатся в нем в значительном количестве. Лекарственную чувствительность можно определять на плотных и жидких питательных средах. В современной лабораторной практике ее обычно определяют на среде Левенштейна- Йенсена. не содержащей крахмала, которая принята ВОЗ в качестве международного стандарта. Унификация определения лекарственной чувствительности МБТ позволяет получать сравнимые результаты при проведении эпидемиологических исследований. При определении лекарственной чувствительности на плотных питательных средах результат учитывают через 3 недели после посева по макроросту МБ'Г на поверхности среды, на жидких питательных средах — через 10-12 дней по наличию микроколоний в виде переплетающихся жгутов и кос в мазках из осадка. Определение лекарственной чувствительности на плотных и жидких питательных средах имеет свои преимущества и недостатки. На плотных средах можно получить более четко сравнимые результаты. При массовых исследованиях этот метод менее трудоемок, однако он более продолжителен по времени получения результата. В плотных средах во время свертывания может несколько уменьшаться содержание некоторых термолабильных препаратов, например, стрептомицина. Определение лекарственной чувствительности на жидких средах более трудоемко, требует микроскопии препаратов, но результат может быть получен в более короткие сроки. Недостатком этого способа является то, что больные, леченные антибактериальными препаратами, могут выделять микобактерий, лишенные корд-фактора, не дающие при размножении жгутов или наукообразных микроколоний, наличие которых служит критерием устойчивости к препарату. Метод соотношения резистентности (resistance ratio method) заключается в определении соотношения минимальных ипгибирующих концентраций противотуберкулезных препаратов для тестируемого штамма и референс-штамма H37RV. чувствительного ко всем препаратам. Величина соотношения 2 и менее характеризует шгамм как чувствительный. 8 и более — как устойчивый. Вариантом метода минимальных ипгибирующих концентраций является E-tcst. Лекарственная устойчивость микобактерий с использованием этого метода определяется на чашках с агаровой средой, на которые помещают полоски, содержащие градиент концентраций противотуберкулезных препаратов. Чувствительность микобактерий к препаратам оценивается по наличию зоны ингибирования роста микобактерий вокруг полоски. Использование E-tesl позволяет определять лекарственную чувствительность МБ'Г в течение 5-10 дней. Метод пропорции был предложен Canetti в 1963 году. Он заключается в определении соотношения числа колоний, выросших на среде, содержащей противотуберкулезный препарат, и числа колоний в контрольной пробирке, не содержащей препарата. Это соотношение является отражением пропорции резистентных бактерий в популяции. Метод позволяет количественно оценить степень резистентности штамма МБТ, однако широкое применение его в классическом варианте затруднено вследствие большой трудоемкости. Определение лекарственной чувствительности микобактерий методом пропорций может проводиться с использованием автоматических систем ВАСТЕС, МО IT, Esp Culture System и др Целью интерпретации результатов определения лекарственной чувствительности МБТ к ПТП являются прогнозирование клинической эффективности ПТП у конкретного больного и обоснование рекомендаций по ОУи. д проведению оптимальной химиотерапии. В качестве критериев для отнесения штаммов МБТ к категории чувствительных или устойчивых используют пороговые значения минимальных ингибирующих концентраций (МИК) ПТП, избранные на основе комплекса микробиологических, фармакокинетических и клинических показателей. Данные о величине МИК Г1ТГ1 в отношении штаммов МБТ, выделенных от больных, служат микробиологическим критерием для определения величины пороговых концентраций. Кроме того, при определении пороговых МИК учитывают данные по фармакокинетике ПТП. Основным показателем при этом является максимальная концентрация Г1ТП, которая создается в сыворотке крови после приема ПТП в среднетераггевтической дозе. Четкая зависимость между этим показателем и величинами пороговых МИК отсутствует. В самом общем веде можно лишь сказать, что пороговые МИК не могут быть выше максимально достижимых в сыворотке крови. И, наконец, третьим критерием для определения пороговых значений МИК служат данные о клинической эффективности ПТГ1 при заболевании, вызываемом микроорганизмами с различными МИК. Таким образом, предложенные в разных странах пороговые значения МИК ПТП являются плодом консенсуса между ведущими экспертами, а не результатом точных расчетов. По мере накопления опыта их периодически пересматривают. Несмотря на определенную условность рекомендованных пороговых значений МИК ПТП, они являются единственной основой для первого этапа интерпретации результатов оценки чувствительности МБТ к Г1ТП. Биологические методы диагностики туберкулеза Биологическая проба (биопроба). Биопроба является еще одним методом выявления микобактерий. Для этого чувствительных к туберкулезу животных (чаще всего морских свинок) заражают патологическим материалом, взятым от больного, и в течение 3 месяцев наблюдают за их весом, поведением, местными изменениями. Если в течение этого срока животное не погибнет, его забивают. Морских свинок, забитых или погибших, обязательно вскрывают и оценивают туберкулезные изменения, произошедшие в их органах животных при развитии специфического процесса. Даже при отсутствии специфических изменений для подтверждения диагноза из лимфатических узлов, легких, печени, селезенки готовят мазки, которые окрашивают по Цилю-Нильсену. Кроме того, кусочки указанных органов гомогенизируют и высевают на питательные среды. В сомнительных случаях выполняют гистологическое исследование тканей. Чувствительность биологического метода выявления микобактерий высока (несколько клеток МБТ на пробу). Однако в последнее время появились сообщения о том, что результат биологического исследования не всегда коррелирует с данными клинико- рентгенологического обследования. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Полимеразная цепная реакция. Получение более совершенных питательных сред, разработка автоматических систем позволяют сокращать сроки выявления и идентификации микобактерий. Однако они все еще остаются достаточно длительными и зависят от количества возбудителя в инфекционном материале. Современные молекулярно- генетические методы открывают в этой области значительные перспективы, так как позволяют с высокой чувствительностью и специфичностью проводить выявление и типирование микобактерий в различном диагностическом материале. Наиболее часто на практике используется молекулярно-генетический метод, в основе которого лежит принцип полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР — принципиально очень простой метод амплификации, т. е. умножения нуклеиновых кислот. Он был открыт в середине 1980-х гг. Кагу Mullis с соавторами (биотехнологическая компания «Cetus», США). Метод ПЦР основан на повторении трех этапов, проходящих при разных температурных режимах. На первом эгапе двухцепочечную ДНК денатурируют путем кратковременного нагрева инкубационной системы до 90-95сС. Таким образом, две цепочки ДНК остаются в растворе в не связанном друг с другом состоянии до тех пор. пока температура не будет понижена. На следующем этапе, получившем название этапа отжига праймеров, который проходит при 40-60°С, с участками одноцепочечных молекул ДНК, фланкирующими последовательность-мишень, связываются праймеры. Это короткие участки РНК длиной около 20 нуклеотидов. Каждая из затравок связывается только с одной цепочкой ДНК. Следующий шаг ПЦР умножение последовательности-мишени с помощью полимеразы. Поскольку инкубационная система на этапе денатурации ншреваегся до 90-95°С, в ПЦР используется термостабильная Taq-полимераза, выделенная из Thermus aquaticus. Этап достройки затравок проходит при 70-75°С. На этом заканчивается первый цикл амплификации. Далее все этапы повторяются 20-25 раз. В результате количество ДНК-мишени возрастает в геометрической профессии. На практике из патологического материала, взятого от больных, при помощи специальных методов выделяют ДНК. К ней добавляют реакционный буфер, смесь нуклеозидтрифосфатов, праймеры, полимеразу и проводят амплификацию в программируемом термостате (термоциклере). Результат учитывают с помощью электрофореза в агарозиом геле или с помощью иммобилизованных фрагментов ДНК. Присутствие в пробе последовательности-мишени свидетельствует о наличии МБТ в исследуемом образце. ПЦР позволяет выявлять 1-10 бактериальных клеток в 1 мл биологического материала. Специфичность реакции — 97-98%. Исследованию методом ПЦР подлежат мокрота, бронхиальный секрет, плевральная и другие жидкости, моча, периферическая и менструальная кровь, соскобы эпителиальных клеток цервикального канала. Следуег отметит ь, что с помощью ПЦР нельзя определить активность туберкулезного процесса, поэтому интерпретировать полученный результат необходимо с учетом клинико-рентгенологических данных. Метод ПЦР можно использовать как дополнительный диагностический метод при дифференциальной диагностике в комплексе с другими методами лабораторной диагностики туберкулеза и нельзя использовать в качестве скринингового метода для выявления больных туберкулезом из-за возможности ложноположительных резуль- iuiob. Кроме ю10. препятствием для широкого использования данного метода служит необходимость использования дорогостоящего оборудования и диагностических наборов. ПЦР — не единственный амплификационный метод детекции микобактерий. Применение амплификационных методик для выявления различий в генетической структуре чувствительных и устойчивых штаммов —• еще один новый подход к определению лекарственной чувствительности микобактерий. Проводит ь данные исследования стало возможным благодаря определению нуклеотидных последовательностей генов, мутации в которых при водят к возникновению резистентности к противотуберкулезным препарат ам. При использовании амплификационных методов значительно сокращаются сроки исследования. Главным ограничением для их применения служит существование других механизмов резистентности. С помощью амплификационных методик не обнаруживается около 10% случаев устойчивости к рифампицину, 20% — к изониазиду и 40% — к стрептомицину. Поэтому молекулярные методы, никогда не смогут полностью заменить классические культуральные методы определения лекарственной устойчивости МБТ. Генотипирование. Исследования по эпидемиологии туберкулеза в течение длительного времени тормозились отсутствием точного и воспроизводимого метода субтитрования клинических изолятов для изучения распространения штаммов МБ'Г. Совершенствование молекулярно-генетических методов позволило разработать высокоспецифичные маркеры для типирования штаммов МБТ. Штаммы МБГ невозможно различить с помощью рутинных биохимических тестов или серологических методов. Устойчивость к ПТП в некоторых случаях является воспроизводимым маркером, но этот маркер не является общепринятым. До недавнего времени единственным пригодным методом для типирования штаммов МВТ служил метод фаг оптирования. Однако он технически сложен и использовался в немногих лабораториях, поскольку не позволяет добиться необходимой специфичности, и с его помощью можно выделить лишь ограниченное число фаготипов. Генотипирование позволяет использовать в качестве маркеров тонкие различия в хромосоме микобактерий, не вызывающие фенотип и ческих различий. Поскольку получаемая в результате исследования картина индивидуачьна для конкретного штамма (как отпечатки патьцев для человека), данный метод получил название геномной дактилоскопии (DNA fingerprint). Для типирования чаще всего используют специфичную для М tuberculosis повторяющуюся мобильную последовательность ДНК, которая демонстрирует необходимый уровень полиморфизма. Число копий этой последовательности высоко у большинства изолятов М. tuberculosis (7-20), низко у большинства изолятов М. bovis от животных (1-4) и у различных штаммов А/, hovis BCG (1-2). Метод генотипирования основан на использовании рсстрикционных эндонуклеаз. которые распознают специфические последовательности и нарезают ДНК на фрагменты разной длины. Содержание гуанина и цитозина в микобактериальной ДНК высоко (около 65%), поэтому целесообразным признано использование энзимов, распознающих фрагменты, богатые аденином и тимином, и разрезающих Д11К на небольшое число крупных фрагментов. Стандартный метод предусматривает следующие этапы: выделение микобактериальной ДНК. ее рестрикцию с использованием эндонуклеаз, разделение рестрикционных фрагментов путем электрофореза и детекцию последовательности-мишени посредством гибридизации с меченой ДНК. Полученная в результате совокупность электрофорегических полос (фингерпринт) отражает число копий данной последовательности ДНК (каждая полоса соответствует одной копии последовательности-мишени), а также гетерогенность в длине рестрикционных фрагментов, которая обычно является результатом точковых мутаций, создающих или уничтожающих сайты рестрикции, либо делеций или других хромосомных перестроек, что нашло отражение в термине «полиморфизм длины рестрикционных фрагментов» {Restriction Fragment Length Polymorphism. RFLP). Использование метода в стандартном варианте осложняется необходимостью экстракции почти 1 мкг OHi. «3 ДНК из каждою изолята. Поэтому в настоящее время разработаны два варианта метода геномной дактилоскопии, основанные на использовании ПЦР. Они позволяют использовать очень маленькое количество ДНК и получать картину, сопоставимую по специфичности со стандартным методом. В таких вариантах исследование может быть выполнено на бактериях из нескольких колоний или старых нежизнеспособных культурах, а также клинических бактериоскопически положительных образцах. Выделенные при вспышке заболевания изоляты МБТ с большой долей вероятности демонстрируют одинаковую генотипическую картину. Поэтому изоляты, связанные с конкретной вспышкой заболевания, можно легко идентифицировать. Однако пока не проведено масштабное исследование с целью определения предполагаемого числа возможных геногипических вариантов в конкретном географическом регионе. Первым применением генотипирования изолятов МБТ было отслеживание вспышек туберкулеза. Так, с использованием этого метода была установлена причина вспышки туберкулеза, вызванной инъекциями контаминированных лекарственных препаратов. Эта работа продемонстрировала полезность геномной дактилоскопии для проведения эпидемиологических исследований и показала, что с использованием данного метода можно идентифицировать изоляты, связанные со вспышкой, среди большого количества изолятов. Доказана полезность геномной дактилоскопии в отслеживании распространения полирезистентных штаммов. В результате нескольких исследований было описано нозокомиальное распространение таких штаммов среди ВИЧ-инфицированных больных. В каждом из таких исследований были идентифицированы 1 или 2 штамма, связанные со вспышкой заболевания. Используемая для типирования последовательность ДНК не кодирует лекарственную чувствительность, поэтому резистентность к ПТП не влияет на картину фингерпринта. Однако в данном случае фингерпринт может служить маркером данного штамма и указывать на лекарственную резистентность новых изолятов с таким же фингерпринтом. При эпидемиологических исследованиях вспышек полирезистентного туберкулеза лекарственная устойчивость указывает на возможность эпидемиологической связи между штаммами, геномная дактилоскопия обеспечивает окончательное доказательство. Метод даже более полезен для проведения исследования полирезистентных изолятов, поскольку это единственный метод доказательства родства штаммов. Широкомасштабное применение этого метода ко всем изолятам в данной географической зоне может выявить циркулирующие штаммы МБТ и идентифицировать ранее неизвестные источники распространения туберкулезной инфекции. Однако в настоящее время еще не установлено, является ли такое применение метода практически осуществимым, поскольку лабораторное изучение изолятов МБТ легче, чем исследования, необходимые для отслеживания распространения штаммов с использованием геномной дактилоскопии. Метод можно также использовать для подтверждения кросс-контаминации культур и других ошибок, допускаемых при лабораторном исследовании. |