Коллоидная химия В.Н. Сергеев. В. Н. Сергеев Курс коллоидной химии для медицинских вузов. Учебник
 Скачать 3.98 Mb.
|
|
8.3. Кислотно- основные свойства белков Важнейшие из природных полимеров белки и нуклеиновые кислоты отличаются от большинства высокомолекулярных соединений тем, что в их состав входят многочисленные различные ионогенные группы. Такие высокомолекулярные соединения называют полиэлектролитами. В зависимости от характера ионогенных групп различают сильные и слабые поликислоты полиоснования, полисоли и полиамфолиты (амфотерные полиэлектролиты. К природным сильным поликислотам относятся, например, агар-агар и естественный антикоагулянт крови гепарин, которые содержат остатки серной кислоты слабые поликислоты с карбоксильными группами — пектин, полигалактуроновая кислота. Природных полиоснований и полисолей не существует, но такие полиэлектролиты синтезированы из мономеров, включающих основные или солевые группы поливиниламин, поливинилпиридинийбромид и другие. Белки являются полиамфолитами. В боковых цепях белки содержат ионизирующиеся группы как кислотного, таки основного характера карбоксильные группы аспарагиновой и глутаминовой кислот, аминогруппу лизина, гидроксигруппу тирозина, гуанидиновую группировку аргинина, имидазольную гистидина и меркаптогруппу цистеина. Кроме того, молекула белка имеет концевые карбоксильную и аминогруппу. В табл. 8.1 приведены области значений pH, в которых имеет место диссоциация кислотных и протонированных основных групп белков. Ниже приведен фрагмент макромолекулы белка, где боковые цепи (R) могут содержать 97 N H 2 C H C R 1 O N H C H C R 2 O N H C H C R 3 O N H C H C R 4 O N H C H C R 5 O N H C H C R n O O Таблица 8.1. Области значений pH, в которых происходит диссоциация ионогенных групп белков Кислотные группы 2 4 6 8 10 12 Сопряженные основные группы –COOH –COO – ( ) –NH 2 ( ) ( ) –NH 2 ( ) –SH Значения pH 2 4 6 8 10 12 14 Все перечисленные ионогенные группы (табл. 8.1) вносят свой вклад в кислотно-основные свойства белков. Для упрощения будем считать, что кислотно-основные свойства белков определяются, главным образом, карбоксильными и аминогруппами. В этом случае макромолекулу белка можно изобразить упрощенной формулой где Pt сокращение от английского protein (белок, примеры значений n и m см. в табл. 8.2. При этом учитывается, что группы –NH 2 и –COOH располагаются не только на концах длинной полипептидной цепи, но ив боковых заместителях, распределенных по всей длине макромолекулы. В растворе белка при определенном значении pH число ионизированных карбоксильных групп равно числу протонированных аминогрупп следовательно, число отрицательных зарядов равно числу положительных и суммарный заряд макромолекулы равен нулю. 98 Такое состояние белка называется изоэлектрическим, а то значение pH раствора, при котором наступает изоэлектрическое состояние, называется изоэлектрической точкой белка, обозначаемой ИЭТ или pI. В изоэлектрическом состоянии белок представляет собой диполярный полиион: (H 3 N + ) n –Pt–(COO – ) m (n m) В зависимости от соотношения числа ионогенных групп белки могут быть нейтральными, для них pI = 5.5 – 7, основными (преобладают основные группы, для них pI > 7 или кислыми (преобладают кислотные группы, для которых pI < 5.5 (см. табл. 8.2). Изоэлектрическая точка большинства белков животных тканей лежит в пределах от 5.5 до 7.0. Однако, в природе есть белки, у которых значения изоэлектрической точки находятся при крайних значения pH среды. Например, величина pI пепсина (фермента желудочного сока) равна 1, а сальмина основного белка из молок семги) — почти 12. Для определения изоэлектрических точек белков применяются различные методы. ИЭТ определяют по электрофоретической подвижности электрофорез — перемещение заряженных частиц в электрическом поле, при pH < pI белок движется к катоду (–), при pH > pI — к аноду (+), а при pH = pI белок неподвижен степени набухания (при pH = pI минимальна растворимости (при pH = pI минимальна скорости застудневания (при pH = pI максимальна вязкости растворов (при pH = pI минимальна величине осмотического давления (при pH = pI минимальна. Таблица 8.2. Характеристики некоторых белков Белок М Число аминокислотных остатков pI Форма макромолекулы общее основных (n) кислых (m) нейтральных Инсулин 8000 50 6 4 40 8.2 глобулярный Пепсин 22000 150 4 71 75 1 глобулярный Альбумин 62000 520 99 126 295 4.7 глобулярный Гемоглобин 66000 570 94 52 430 6.8 глобулярный Коллаген 135000 960 85 124 750 6 фибрилярный Фибриноген 360000 2000 поровну 60% 6.0 фибрилярный Кислотно-основные свойства белков, как полиамфолитов, проявляются в том, что они в зависимости от pH растворов могут находиться в различных формах белок-кислота (поликатионы), белок-основание (полианионы) ив виде диполярного полииона (белок-соль). При изменении pH происходит превращение одних форм белка в другие, причем эти превращения обратимы в определенных границах изменения pH (схема 8.1). 99 p H = È ÝÒ (p I) ä è ï î ë ÿð í û é ï î ë è è î í "á åë î ê -ñî ë ü" è çî ýë åê òð è ÷åñê î å ñî ñòî ÿí è å (È ÝÑ) m H n H (H 3 N ) n P t(C O O H ) m (H 3 N ) n P t(C O O ) m (H 2 N ) n P t(C O O ) m àí è î í í û å ô î ð ì û "á åë î ê -î ñí î â àí è å" p H > p I (полианионы ) (поликатионы ) ê àòè î í í û å ô î ð ì û "á åë î ê -ê è ñë î òà" p H < p Схема 8.1. Кислотно-основные свойства белков Белки вносят существенный вклад в поддержание кислотно-щелочного равновесия в живом организме за счет проявления буферных свойств. В отличие от низкомолекулярных буферных систем области буферного действия белков-полиамфолитов более широки, так как белковые молекулы способны образовывать много пар сопряженных кислот и оснований, поэтому они противодействуют как подкислению, таки подщелачиванию среды. Интервалы pH, в которых проявляется буферное действие белков, и величина буферной емкости их растворов зависят от аминокислотного состава белков. Для большинства белков буферная емкость уменьшается вблизи изоэлектрической точки, так как значения pK a большинства ионогенных групп существенно больше или меньше pI. Исключением является гемоглобин. В этом белке 8% от общего содержания аминокислот составляет гистидин, для которого значение pK a имидазольного фрагмента близко к значению pI этого белка. Поэтому гемоглобин эритроцитов, находясь практически в изоэлектрическом состоянии, обеспечивает около 25% буферной емкости крови. Следует отметить, что гемоглобиновая буферная система эритроцитов действует в сопряжении с гидрокарбонатной системой плазмы крови. Схема 8.2. Сопряжение белковой и гидрокарбонатной буферных систем Равновесия (аи (б) тесно связаны между собой. Рост концентрации CO 2 (за счет повышения продуцирования при мышечной работе или за счет снижения удаления придыхательной недостаточности) сдвигает равновесие реакции (а) вправо, а реакции (б) — влево, следовательно, увеличение концентрации ионов HCO 3 – соответствует снижению концентрации ионов Pt – и наоборот. В результате такого сопряжения сумма концентраций HCO 3 – и Pt – , обозначаемая в терминах кислотно-щелочного баланса "BB" (buffer base), остается неизменной, равной в норме 42 ммоль/л. Клетки и ткани организма также проявляют заметное буферное действие благодаря белкам. Своеобразие белков-полиамфолитов проявляется также в самопроизвольном образовании ими лиофильных термодинамически устойчивых растворов и, что особенно важно, в зависимости пространственной формы макромолекул от pH растворов. Вводных растворах белков диполи воды определенным образом ориентируются вокруг заряженных групп –COO – и –NH 3 + и образуют гидратные оболочки макромолекул, создавая плавный переход от органических молекул к неорганическому растворителю, что делает макромолекулы 100 лиофильными (гидрофильными, а чем лиофильнее частицы в системе, тем она термодинамически устойчивее. Влияние кислотности среды на пространственную форму макромолекул определяет зависимость практически всех физико -химических свойств растворов белков от pH. В изоэлектрическом состоянии гибкие макромолекулы свернуты в более или менее компактные клубки вследствие взаимного притяжения разноименных зарядов. В более кислой или более щелочной (по сравнению с pI) среде в макромолекуле преобладают заряды одного знака ив результате их взаимного отталкивания молекулы распрямляются и существуют в растворе в виде длинных гибких цепочек (рис. 8.1). p H < p I p H = p I p H > p Рис. 8.1. Влияние pH среды на пространственную форму макромолекул В соответствии с такими изменениями форм макромолекул свойства растворов белков, как уже упоминалось, проходят через экстремальные значения в изоэлектрической точке осмотическое давление и вязкость, набухание и растворимость минимальны в ИЭТ, скорость застудневания и высаливание в ИЭТ максимальны. 8.4. Варианты вопросов из ада ч для самостоятельной работы Вариант 1 1. Охарактеризуйте приведенные ниже ВМС: а) по происхождению (природные, синтетические, б) по механизму образования (полимеризационные, поликонденса- ционные), в) по типу атомов в главной цепи (карбоцепные, гетероцепные), г) по структуре (линейные, разветвленные, лестничные целлюлоза, поливинилацетат, амилопектин, искусственное волокно, натуральный каучук, гемоглобин, РНК. 2. Тождественны ли понятия полимер, полиэлектролит, полиамфолит? Какие из нижеперечисленных соединений можно отнести к указанным веществам полиаланин, полиакриловая кислота, каучук, целлюлоза, полиэтилен 3. Правильныли утверждения, что 1) макромолекулы ВМС и коллоидные частицы одинаковы по а) размерам, б) форме, в) гибкости, г) лиофильности 2) растворы ВМС не образуются самопроизвольно и термодинамически неустойчивы 3) растворы ВМС являются равновесными лиофильными системами 4) растворы ВМС являются коллоидными системами 4. Процесс ступенчатой ионизации кислотных и основных функциональных групп в молекуле белка в зависимости от pH можно упрощенно представить схемой 101 (NH 3 + ) n Pt(COOH) m (NH 3 + ) n Pt(COO − ) m + m H + (NH 2 ) n Pt(COO − ) m + n H + (1) катионные формы (2) диполярный полиион (3) анионные формы белок-кислота, pH pI m = n ИЭС, pH = pI белок-основание, pH pI Какие формы белка образуют буферную систему в растворе с pH pI? 5. ИЭТ многих белков крови лежит в слабокислой области pH. Какие функциональные группы (кислотные или основные) преобладают в составе макромолекул этих белков 6. Раствор, содержащий белки альбумин (pI = 4.7), и глобулин (pI = 6.4) имеет pH = 8.0. Какие по знаку заряды имеют данные белки в этом растворе и к какому электроду (катоду или аноду) они будут перемещаться при электрофорезе Какой белок будет перемещаться быстрее (считать, что радиусы сольватированных белков одинаковы 7. Рассчитайте, сколько молекул воды может теоретически связать одна молекула желатина, содержащая в своем составе 140 свободных групп – COOH, 90 групп –NH 2 и 900 пептидных связей, если принять, что одна группа –COOH связывает 4 молекулы воды, группа –NH 2 — 2 – 3, а пептидная связь — 1 молекулу. Ответ 1685) 8. При каком из указанных значений pH раствора белка миоглобина (pI = 8.2) он будет обладать максимальной электрофоретической подвижностью а) 5.3; б) 7.1; в) 8.3? Вариант 2 1. Охарактеризуйте приведенные ниже ВМС: а) по происхождению биополимеры, синтетические ВМС), б) по механизму образования полимеризационные, поликонденсационные), в) по типу атомов в главной цепи (карбоцепные, гетероцепные), г) по структуре линейные, разветвленные, сетчатые амилоза, полипропилен, гликоген, шерсть, бутадиеновый каучук, глобулин, ДНК. 2. В чем состоит различие между полиамфолитами и поликислотами Какие из перечисленных соединений относятся к указанным веществам нуклеиновая кислота, поли-L-лизин, поливиниламин, альбумин, гепарин 3. Правильныли утверждения, что 1) макромолекулы ВМС отличаются от коллоидных частица) размерами, б) формой, в) гибкостью, г) лиофильностью 2) растворы ВМС образуются самопроизвольно и термодинамически устойчивы 3) растворы ВМС являются неравновесными лиофобными системами 4) растворы ВМС являются истинными 4. Объясните, почему белки обладают широким диапазоном буферного действия, тогда как, например, у ацетатной буферной системы область буферного действия находится в пределах pH от 3.75 до 5.75? 5. ИЭТ сывороточного альбумина равна 4.7. Что можно сказать о соотношении кислотных и основных групп в его молекуле 6. Раствор, содержащий белки -лактоглобулин (pI = 5.2), и глобулин (pI = 6.6) имеет pH = 5.0. Какие по знаку заряды имеют данные белки в этом растворе и к какому электроду (катоду или аноду) они будут перемещаться при электрофорезе Какой белок будет перемещаться быстрее (считать, что радиусы сольватированных белков одинаковы 102 7. Рассчитайте, сколько молекул воды связано в растворе с одной молекулой альбумина и с одним аминокислотным остатком, если известно, что 1 г альбумина связывает 0.3 г воды, M = 68000 г/моль, число аминокислотных остатков 515. Ответ 1133; 2.2) 8. При каком из указанных значений pH раствора белка глобулина (pI = 6.4) он будет обладать максимальной электрофоретической подвижностью а) 3.7; б) 6.3; в) 8.0? 9. ОБРАЗОВАНИЕ РАСТВОРОВ В МС. Набухание Взаимодействие полимеров с растворителями начинается с набухания, предшествующего образованию ими растворов. Набухание — это самопроизвольный процесс избирательного поглощения низкомолекулярного растворителя высокомолекулярным соединением за счет односторонней диффузии растворителя, сопровождающийся увеличением массы и объема полимера. Набухание сопровождает жизнедеятельность всех растительных и животных организмов. Почки человека помимо основной функции (выведение из организма продуктов обмена веществ) осуществляют регулирование количества воды, а их соединительная ткань служит индикатором водного обмена между кровью и клетками. Вследствие набухания соединительная ткань способна принимать излишек воды и отдавать его клеткам или направлять в кровь. Процесс набухания обычно протекает в две стадии. Первая стадия. Полимер поглощает до 20 – 30% (от массы сухого полимера) растворителя. Движущей силой первой стадии является диффузия молекул низкомолекулярного растворителя в ВМС. В случае набухания белков вводе происходит гидратация макромолекул, обусловленная электростатическим взаимодействием диполей воды и зарядов макромолекул, возникающих при ионизации различных функциональных групп. Диполи воды в гидратных оболочках определенным образом ориентированы и структурированы (упорядочены и уплотнены. Образование гидратной оболочки сопровождается выделением тепла (теплота набухания) — H < 0. Вода, образующая гидратные оболочки, называется "связанной, она обладает такими же химическими свойствами, как и обычная, но вследствие своей структурированности отличается физическими меньшей упругостью пара, худшей растворяющей способностью, повышенной плотностью (до 1.2 – 1.4 г/мл), пониженной температурой замерзания доит. д. Чем больше гидрофильность макромолекулы белка, тем большее количество воды он связывает. Например, в студне желатина масса связанной воды в 2 раза больше массы сухого белка. В жизни животных и растительных организмов связанная вода играет важную роль, так как ее присутствие обеспечивает морозоустойчивость, поддерживает запасы воды, определяет морфологические структуры тканей и клеток. В человеческом организме доля связанной воды составляет 70% у младенцев, снижаясь к старости до 40%. Высокое содержание связанной воды в тканях и протоплазме, представляющих собой сложнейшие системы, образованные биополимерами, обуславливает высокую эластичность и 103 проницаемость этих систем — свойств, необходимых для активного процесса обмена веществ, роста и развития организмов. Уменьшение количества связанной воды вызывает снижение этих свойства как следствие — дряблость мыщц и кожи, появление морщин, уменьшение сопротивляемости к низким температурами, что самое главное, замедление и ухудшение качества обменных процессов. Объем системы белок—вода на первой стадии набухания не увеличивается, а, как правило, даже уменьшается, такое явление называется контракцией. Причинами контракции являются ориентация молекул воды в гидратных оболочках, что приводит к уплотнению системы, а также проникновение молекул воды в промежутки между макромолекулами, ведущее к большей компактности системы. Вторая стадия. На второй стадии набухание происходит без выделения теплоты, поглощается до 70 – 80% (от массы сухого полимера) воды это "свободная" вода, в которой и растворяется гидратированный белок. Движущей силой второй стадии является осмос, так как гидратированный белок представляет собой полупроницаемую мембрану. Происходит увеличение объема белка, связи между макромолекулами ослабевают и возрастает число их свободных конформаций — S > 0. Расстояния между макромолекулами увеличиваются, отдельные макромолекулы отрываются от набухшего белка и медленно диффундируют в растворитель. Если что-либо препятствует увеличению объема системы, возникает давление набухания (до 100 – 1000 атм. Рис. 9.1. Стадии набухания а — система белок + вода до набухания б — первая стадия набухания, наблюдается контракция в — вторая стадия набухания, наблюдается увеличение объема белка г — вторая стадия набухания с частичным растворением белка д — образовался раствор белка Набухание полимеров характеризуется степенью набухания : 100 0 0 m m m (%) или 100 0 0 V V V (%), где m и V, соответственно, масса и объем ВМС после набухания m 0 и V 0 — масса и объем ВМС до набухания. Степень набухания может изменяться от десятков до тысяч процентов для биополимеров степень набухания обычно не превышает 1600%. Различают неограниченное и ограниченное набухание. В первом случае полимер поглощает растворитель, затем при той же температуре постепенно переходит в раствор, те. происходит растворение полимера. При ограниченном набухании процесс останавливается на второй стадии набухания независимо от времени пребывания полимера в растворителе, при этом образуется студень. 104 Причинами ограниченного набухания могут быть ограниченная растворимость ВМС в растворителе вследствие отсутствия сродства между ними, например, по полярности, так, неполярный натуральный каучук в полярном спирте набухает ограниченно наличие мостиковых связей между макромолекулами, например, дисульфидных мостиков –S–S– в вулканизированном каучуке, которые не позволяют макромолекулам отделяться друг от друга и переходить в раствор. Иногда между ограниченными неограниченным набуханием нельзя провести четкую границу, так как полимер ограниченно набухающий в одних условиях, может неограниченно набухать в других желатин в холодной воде набухает ограниченно и неограниченно — в теплой. |