пособие Лапшина. И психофизиологические методы оценки уровня стресса и его преодоление
 Скачать 441.36 Kb.
|
|
ГЛАВА 2. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭНДОКРИННОГО СТРЕССОВОГО ОТВЕТА Реакция организма на стресс тесно связана с гормональным фоном, а точнее говоря с эндокринным статусом особи. Поэтому при изучении влияния различных моделей стресса важным является оценка гормонального статуса организма, и в первую очередь ГГАС (гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы). Глюкокортикоиды – гормоны коркового вещества надпочечников, оказывающие влияние на все виды обмена в организме. У человека основным и наиболее активным глюкокортикоидом является кортизол, у крыс (животные, которые наиболее часто используются в постановке экспериментальных моделей) – кортикостерон. Один из главных метаболических эффектов – активация глюконеогенеза. Глюкоза, синтезированная под действием стероидов, используется как источник энергии при различных нестандартных ситуациях. Глюкокортикоиды принято называть гормонами стресса, потому как повышение их уровня способствует адаптации организма к стрессу. Определение содержания кортикостерона (флюорометрический микрометод Балашова Ю.Г.) Принцип метода. Кортикостероиды, выделенные путем экстракции из исследуемого материала, имеющие гидроксилы при 11 и 21 углеродных атомах и Δ4 – 3 – кетогруппировку в кольце А, обнаруживают флюоресценцию после обработки проб смесью концентрированной серной кислоты и этилового спирта. Флюоресценция кортикостерона развивается медленно и становится наиболее интенсивной через 1,5-2 часа Используемые реактивы: Хлористый метилен Смесь серная кислота/абсолютный спирт (7:3) Стандартные растворы кортикостерона, которые необходимы для построения калибровочного графика. Ход определения: В пробирки вносят 100 мкл исследуемой сыворотки крови, затем добавляют 1,5 мл хлористого метилена, встряхивают на лабораторном шейкере и быстро замораживают при – 300С. Полученный экстракт переносят в чистую пробирку, а затем добавляют 500 мкл флюорогенного реактива (смесь концентрированной серной кислоты: абсолютный этанол, 7:3). Пробы встряхивают на шейкере, отстаивают 5 минут, после чего удаляют верхний слой хлористого метилена. Через 1,5-2 часа проводят измерение нижнего слоя на флюориметре при длине волны возбуждения флюоресценции 405 нм, эмиссии 546 нм. Данная методика используется для определения главного глюкокортикоидного гормона крыс – кортикостерона. Изменение его уровня в ту или иную сторону может свидетельствовать о стрессовом расстройстве. Кроме вышеуказанного метода, для определения кортикостерона можно использовать метод твердофазного иммуноферментного анализа с использованием специализированных наборов реагентов. Данный метод подходит для определения кортикостерона в надпочечниках. После извлечения надпочечника из тушки животного производят его очищение от прилегающих тканей, а затем взвешивание. Готовят гомогенат, который сначала проходит стадию центрифугирования, а затем полученный супернатант проходит вышеописанные стадии. Определение содержания кортизола в сыворотке крови Для человека основным глюкокортикоидным гормоном является кортизол. Для его определения можно воспользоваться как флюорометрическим методом (при наличии стандартных растворов кортизола), так и более современным – иммуноферментным анализом, используя наборы реагентов, например «КОРТИЗОЛ – ИФА – БЕСТ» (Вектор -Бест, Россия). Адренокортикотропный гормон (АКТГ) – гормон передней доли гипофиза, контролирует синтез и секрецию гормонов коры надпочечников. Поэтому его исследование при изучении влияния стресса на организм является важным звеном. Определение содержания АКТГ в сыворотке крови Количественное определение АКТГ в сыворотке крови целесообразно проводить с помощью иммуноферментного метода, используя видоспецифичные наборы, к примеру, набор «ACTH» (Adrenocorticotropic Hormone, ELISA, Biomerica, Inc., США) подходит для определения гормона только у человека. Катехоламины — это физиологически активные вещества- медиаторы и гормоны симпатоадреналовой системы. Синтезируются в мозговом слое надпочечников и головном мозге адренергических нейронов. Быстрая секреция катехоламинов является приспособительной неспецифической реакцией на изменения окружающей или внутренней среды. Определение содержания адреналина, норадреналина, дофамина и ДОФА Принцип метода Анализ осуществляют методом колоночной хроматографии с адсорбцией на окиси алюминия и детектированием флуоресценции продуктов окисления при рН 4,2; 6,2 на флуориметре, например, «ФЛЮОРАТ-02-АБЛФ-Т» с использованием наборов светофильтров I – 410-520 нм; II – 360-520 нм; III – 360-410 нм. Используемые реактивы: Стандартные растворы адреналина, норадреналина, дофамина, ДОФА (1000 мкг/мл) Уксусная кислота 0,25Н; 5Н Растворы аммика 1,0Н, 0,5Н Трихлоуксусная кислота 10% Окись алюминия 1,0г Уксусная кислота 0,25Н Соляная кислота 1,0Н Фосфатный буфер рН 4,2; рН 6,2 Бидистиллированная вода Феррицианид калия 2,5 г/л Водный раствор йода 0,02Н Щелочной аскорбинат натрия 2г/л NaOH 5Н Ход определения: Исследование содержания катехоламинов в крови и порции мочи рекомендуется проводить сразу после забора биоматериала. Анализ содержания катехоламинов и ДОФА проводится в стабилизированной суточной моче. Приготовление стандартных растворов (1000 мкг/мл) адреналина, норадреналина, дофамина, ДОФА проводят следующим образом: 10 мг сухого вещества растворяют в 5 каплях конц. соляной кислоты, а затем доводят до объема 10 мл бидистилированной водой. Далее из основного стандарта готовят растворы со следующими концентрациями: 50,0 нг/мл; 25,0 нг/мл; 10,0 нг/мл; 1,0 нг/мл. Разведение необходимо проводить 0,25Н уксусной кислотой. Гидролиз конъюгированных форм катехоламинов проводят путем кипячения мочи, подкисленной до рН=1. Затем к 17,5 мл фильтрата мочи необходимо добавить ЭДТА (250 мг) и довести рН до 8,2-8,5 1,0Н раствором NH3. Для экстракции катехоламинов из сыворотки крови используют 10% ТХУ, нагревая раствор до 40С в течении 30 минут, не допуская образования преципитатов. Адсорбцию необходимо проводить в хроматографической колонке на 1,0г окиси алюминия. Окись алюминия, используемую для колонки, предварительно отчищают по Брокману. Перед использованием колонку промывают бидистилированной водой (10 мл) со скорость 1,0-2,0 мл/мин. После этапа адсорбции, Al2O3 дважды промывают бидистилированной водой (5 мл) с добавлением капли 0,5Н NH3. Элюция проводится в две стадии, а в качестве элюентов используют 0,25Н уксусную кислоту в объеме 7,0 мл и 1,0Н соляную кислоту в объеме 3,5мл. Полученный солянокислый элюент доводят бидистилированной водой до 7 мл. Дифференцирование катехоламинов осуществляют при разных значениях рН среды и по разнице спектральных характеристик. Для определения флюоресценции окисленного продукта адреналина уксуснокислый элюент доводят до рН 4,2 и отбирают эквивалент 1,0 мл материала в контрольную и опытную пробы в пробирки с 1,0 мл фосфатного буфера (рН 4,2). Для определения флюоресценции окисленных продуктов норадреналина, дофамина и части ДОФА солянокислый и уксуснокислый элюенты доводят до рН 6-7,2. Эквиваленты 1,0 мл материала переносят в пробирки с фосфатным буфером рН 6,2 (опыт и контроль) для исследования содержания норадреналина и ДОФА. Для определения дофамина в пробирки для опыта и контроля предварительно добавляют 0,5 мл фосфатного буфера с рН 6,2 и 1,0 мл бидистилированной воды. Окисление опыта проводят 0,1мл раствора феррицианида калия (2,5г/л) в течение 4 минут, для окисления опыта дофамина используют 0,2 мл 0,02Н водного раствора йода и экспозицию в 7 минут. По истечению времени окисления и в опыты, и в контроли добавляют 1,0 мл щелочного аскорбината натрия (2 г/л), в опыт дофамина вносят 0,5 мл щелочного сульфита. Через 3 минуты в контроли добавляют 0,1 мл феррицианида калия, в контроль дофамина - 0,45 мл 5Н NaOH и доводят объем водой до 4,0 мл. В опыт и контроль исследования дофамина через 7 минут после добавления щелочного сульфита, вносят 0,8 мл 5Н уксусной кислоты. Стабильность флуоресценции продуктов окисления адреналина, норадреналина и ДОФА поддерживают на холодной бане. Максимальной флуоресценции диоксииндола дофамина добиваются кипячением на водяной бане в течении 40 минут. Флуоресценцию регистрируют при I наборе светофильтров, по разнице показателей окисления опыта и контроля при рН 4,2 определяют флуоресценцию адренолютина. Совместную флуоресценцию окисленных норадреналина и адреналина (рН 6,0-7,2) определяют при I наборе светофильтров. Для определения флуоресценции норадренолютина используют разницу показателей свечения реакций окисления при рН 6,0-7,2 и рН 4,2. Совместную флуоресценцию адреналина, норадреналина и ДОФА определяют, используя II набор светофильтров. По концентрации адреналина и норадреналина в 1 мл элюента и флуоресценции стандартных растворов этих моноаминов с использованием II набора светофильтров, рассчитывают содержание ДОФА в уксуснокислом элюенте. Используя II набор светофильтров оценивают уровень свечения окисленного продукта ДОФА в солянокислом элюенте. Флуоресценцию дофамина регистрируют при III наборе светофильтров, с учетом концентрации ДОФА и его свечения при окислении раствором йода. Иммуногистохимическое определение вазопрессина и окситоксина После декапитации у животных извлекают гипоталамусы вместе с гипофизами, затем фиксируют в жидкости Буэна, заливают в парафин и изготавливают серии срезов толщиной 6 мкм. Иммуногистохимически выявляют вазопрессин и окситоцин, используя антисыворотки к этим нейрогормонам. Все срезы обрабатывают одномоментно. Разведение всех иммунологических реагентов, а также время инкубации, всегда были постоянными. Производят обработку гидрохлоридом 3,3-диаминобензидина, а затем срезы докрашивают гематоксилином Эрлиха. Размеры ядрышек нейросекреторных клеток используют в качестве показателя интенсивности синтеза белка и пептидов. Измерение диаметра ядрышек вазопрессин- и окситоцинергических нейросекреторных клеток гипоталамуса производят под микроскопом при общем увеличении 1250х, расчет проводят на 100 клеток. Содержание вазопрессин-, окситоцин- и кортиколиберин-иммунопозитивного материала в задней доле гипофиза и в наружной зоне срединного возвышения определяют по оптической плотности в монохроматическом свете с длиной волны 550 нм на микроскопе (например, ЛЮМАМ-И2 с микроцитофотометрической насадкой ФМЭЛ-1А). Площадь зонда составляла 125 мкм. У каждой крысы необходимо проанализировать по 10 измерений на 5-6 срезах средней части задней доли гипофиза (ЗДГ) и наружной зоне срединного возвышения (НЗСВ). МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА Одним из наиболее важных метаболических процессов, наряду с биоэнергетикой, обменом углеводов и липидов, является свободнорадикальное окисление. Активные формы кислорода (АФК) в физиологических условиях участвуют во многих регуляторных и метаболических процессах. В тканях происходит непрерывная генерация АФК, которая обеспечивает сохранение нормального метаболического фона, необходимого для функциональной активности клеток. Поэтому любая стрессовая реакция организма, как и любой адаптивный процесс, закономерно сопровождается изменениями свободнорадикального окисления, а окислительный стресс является одним из важнейших звеньев адаптации организма на клеточном уровне. По этой причине, исследования изменений свободнорадикального окисления и функции антиоксидантной системы являются одним из ключевых звеньев в изучении действия стрессоров на организм. Содержание продуктов перекисного окисления липидов (спектрофотометрический метод Волчегорского И.А. и соавт.) Принцип метода Данный методический подход основан на феномене перегруппировки двойных связей в диеновые коньюгаты при переокислении полиненасыщенных жирных кислот, сопровождающейся появлением максимума поглощения при 230 - 238 нм, что позволяет судить о содержании гидроперекисей в липидном экстракте по величине его оптической плотности при этих длинах волн. Окислительная деструкция липидных гидроперекисей сопровождается появлением ещё одного максимума в спектре поглощения при 260 - 290 нм. Некоторая неопределённость границ данного "пика" связана с разнообразием веществ, обуславливающих поглощение в упомянутой области спектра. Наряду с триеновыми конъюгатами к ним относятся различные карбонильные интермедиатов ПОЛ, что позволяет расценивать соответствующую оптическую плотность липидной вытяжки как интегральную меру содержания продуктов деструкции гидроперекисей и показатель нарастающего сопряжения двойных связей в переокисленных ациллах. Изложенные особенности ПОЛ-индуцированных сдвигов в спектре поглощения липидов позволяют осуществлять параллельную регистрацию как первичных, так и вторичных продуктов липопероксидации (т.е. диеновых конъюгатов и карбонильных производных соответственно). В качестве экстрагента используют смесь гептана и изопропилового спирта, что позволяет разделять липидную вытяжку на фазы различной полярности путём добавления воды. При этом верхняя (гептановая) фаза сосредотачивает большую часть триацилглицеридов (резервных липидов), в то время как водноспиртовая фаза содержит основное количество мембранных фосфолипидов (структурных липидов). Используемые реактивы: 0,1% раствор ЭДТА (вес:вес) в 0,9% водном растворе NaCl или в другой изотонической среде. Смесь гептан-изопропиловый спирт в объёмном соотношении 1:1. Смесь гептан-изопропиловый спирт в объёмном соотношении 3:7. Водный раствор соляной кислоты (рН = 2); Сухой NaCl Центрифуга УФ – спектрофотометр Ход определения В пробирку из химически устойчивого пластика (лучше из фторопласта) вносят 0,5 мл гомогената ткани в изотоническом растворе, содержащем 0,1% ЭДТА или равный объём ЭДТА-стабилизированной плазмы крови (конечная концентрация ЭДТА в плазме 1 мг/мл). Добавляют 5 мл смеси гептан-изопропанол в объёмном соотношении 1:1. Пробирку закрывают металлической или пластиковой пробкой, резко встряхивают рукой и помешают в лабораторный шейкер на 20 минут. Затем экстракт освобождают от белкового преципитата и других корпускулярных примесей центрифугированием. Осветлённый экстракт переносят в высокие стеклянные пробирки и разбавляют 5 мл смеси гептан-изопропанол (объёмное соотношение смеси 3:7). В разбавленную липидную вытяжку вносят 2 мл раствора соляной кислоты (рН = 2) и в течение 30 минут ожидают полного разделения экстракта на фазы. Верхнюю (гептановую) фазу осторожно декантируют и переносят в отдельную пробирку. При этом следует избегать частичного смешивания фаз, которое может привести к помутнению верхнего слоя. Водноспиртовую часть липидной вытяжки освобождают от воды и растворённых в ней примесей при помощи NaCl. Для этого в освобождённый от гептановой фазы экстракт добавляют не менее 1 грамма сухого NaCl. После внесения соли пробирку встряхивают и оставляют на 30 минут для отделения водной фазы. Изопропанольную фазу декантируют, избегая её контаминации водной фазой. Приготовление оптических контролей (растворов сравнения) осуществляется в целом так же, как это указано для опытных проб. Единственное различие касается замены биологического образца на эквиобъёмное количество среды для суспендирования тканей (0,5 мл 0,1% ЭДТА в 0,9% NaCl). Спектрофотомерия каждой фазы липидного экстракта осуществляется в кварцевых кюветах толщиной 1 см против соответствующего оптического контроля. Замеры проводятся при трех длинах волн: 220,232 и 278 нм. Поглощение при 220 нм соответствует нисходящему плечу максимума оптической плотности изолированных двойных связей и отражает степень ненасыщенности липидов [Error: Reference source not found]. Расчет Результат выражается в виде индексов окисления - Е232/Е220 и Е278/Е220, которые отражают относительный уровень первичных и вторичных продуктов ПОЛ соответственно. Определение содержания конечных продуктов перекисного окисления липидов спектрофотометрическим методом Принцип метода Продукты перекисного окисления липидов, содержащие карбонильные группы, способны взаимодействовать со свободными аминогруппами различных веществ (фосфолипидов, аминолипидов, белков и др.) с образованием соединений типа шиффовых оснований. Последняя группа соединений является структурной основой липофусцинов (кероида), представляющих собой неметаболизируемые маркеры дистрофических процессов в клетке. Общеизвестным аналитическим подходом к определению конечных продуктов ПОЛ является флюоресцентная детекция этих соединений (спектрофотометрические методы не используются, поскольку шиффовы основания обладают высокой способностью к изомеризации, что существенно отражается на спектре поглощения.) Вместе с тем известно, что в области 401- 404 нм находится изосбестическая точка для этих соединений, которая не зависит от вида изомеров. Используемые реактивы: Те же, что и для метода «Содержание продуктов перекисного окисления липидов» (см. выше) Ход определения Получение липидных экстрактов, а также определение первичных, вторичных продуктов ПОЛ проводят по приведенному выше методу. Содержание конечных продуктов ПОЛ определяют по величине оптической плотности гептановых и изопропанольных фаз липидных экстрактов при 400 нм (толщина оптического слоя 2 см). Расчет Относительное содержание шиффовых оснований рассчитывают по отношению поглощения при 400 нм к оптической плотности при 220 нм. Определение интенсивности аскорбат-индуцированного ПОЛ Принцип метода базируется на индукции липопероксидации в изопропанольных экстрактах исследуемых тканей с помощью аскорбиновой кислоты и двухвалентного железа. Используемые реактивы: Те же, что и для метода «Содержание продуктов перекисного окисления липидов» (см. выше) Железо (II) сернокислое Кислота аскорбиновая Ход определения Получение липидных экстрактов, а также определение первичных, вторичных продуктов ПОЛ проводят по приведенному выше методу. Для изучения интенсивности индуцированного ПОЛ (окисляемости липидов) к изопропанольным экстрактам биологических жидкостей (сыворотки крови, слюны) добавляют индуцирующую ПОЛ смесь (0,5 мМ аскорбиновой кислоты и 50 мкг сульфата железа). После чего через 10 минут, когда наблюдается наибольшее изменение содержания молекулярных продуктов липопероксидации, проводят их спектрофотометрическое определение. Окисляемость липидных экстрактов оценивают по соотношению величин оптических плотностей Е232/Е220, Е278/Е220, определяемых до и после внесения инициирующей ПОЛ смеси и выражают в процентах по отношению к исходному уровню. Определение содержания малонового диальдегида Принцип метода Выявление и количественное определение малонового диальдегида по реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК – реактивные продукты). Существенный недостаток метода – низкая специфичность. Используемые реактивы: 28% водный раствор ТХУ, содержащий ЭДТА в концентрации 0,1% 1% раствор ТБК в 50% водном растворе уксусной кислоты 0,04 М Na-фосфатный буфер (рH= 7,4) Центрифуга, водяная баня, фотометр Ход определения Перед проведением ТБК-теста исследуемый образец разводят буфером до конечной концентрации порядка 1%. 2 мл этого разведения депротеинируют добавлением 1 мл 28% ТХУ. Безбелковый экстракт отделяют 10-минутным центрифугированием при 3000 об/мин. 2 мл депротеината смешивают с 1 мл раствора ТБК в высоких стеклянных пробирках, которые затем помещают в кипящую водяную баню на 15 минут. Оптическую плотность регистрируют на спектрофотометре при 532 нм в односантиметровом оптическом слое. Экстинкцию измеряют против оптического контроля, который проводится через все вышеописанные этапы и содержит среду выделения вместо исследуемого образца. Расчет производят по формуле:   где ΔЕ – оптическая плотность; В- объем водной фазы (мл). 106- коэффициент пересчета в мкмоль; 1,56×105 – коэффициент молярной экстинкции; С – исходный объем образца (мл). Определение уровня спонтанной и металл-катализируемой окислительной модификации белков (метод Е.Е. Дубининой) Принцип метода Метод основан на том, что продукты свободнорадикального окисления белков могут количественно реагировать с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов. При этом происходит образование как минимум двух категорий продуктов, подлежащих спектрофотометрической детекции: альдегидфенилгидразонов, поглощающих монохроматический свет с длиной волны 270 нм, и кетондинитрофенилгидразонов, поглощающих монохроматический свет с длиной волны 360-370. Используемые реактивы: Трихлоруксусная кислота, 20% 2М соляная кислота 0,1 М раствор 2,4 динитрофенилгидразина на 2М HCl. 8М Мочевина Смесь этанол-этилацетат (1:1) Смесь 10 мМ Fe2+ и 10 мМ ЭДТА 0,3 мМ Н2О2 Спектрофотометр Центрифуга Ход определения Для определения использовали 0,1 мл 10% гомогената исследуемой ткани или плазмы крови. После обработки ТХУ, в первую порцию (опыт) добавляли 0,1 мл 0,1М раствора 2,4-динитрофенилгидразина (2,4-ДНФГ), а во вторую порцию (контроль) – 0,1мл 2М раствора HCl. Далее пробы инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, и для получения белкового осадка центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут. Осадок промывали 2 раза в 5 мл смеси этанол-этилацетат (1:1) для экстракции липидов и 2,4-ДНФГ, который не прореагировал с карбонильными группами модифицированных белков. Полученный очищенный осадок высушивали для удаления растворителей и растворяли в 2,5 мл 8 М раствора мочевины. Для лучшего растворения белкового осадка в каждую пробу добавляли 15 мкл 2М раствора НСl. Оптическую плотность полученных растворов измеряли при 270 и 370 нм. Расчет производился исходя из коэффициента молярной экстинкции динитрофенилгидразонов. Определение железо-зависимого образования битирозина в плазме крови Принцип метода В результате окисления остатков фенилаланина в молекулах белка образуется стабильный к влиянию протеаз битирозин, обладающий характерной голубой флюоресценцией. Используемые реактивы: Фосфатный буфер, 1 /15 М, рН 7,4. FeSO4 0,65 × 10-4 М. ЭДТА 0,85 х 10-4 М. Н2О2, 0,6 х 10-3М. Ход определения В контрольную пробу вносят 0,95 мл фосфатного буфера и 50 мкл исследуемого образца. Опытная проба содержит 0,85 мл фосфатного буфера, 50 мкл исследуемого образца, 50 мкл смеси растворов сернокислого железа и ЭДТА (1:1), 50 мкл перекиси водорода. Контрольную и опытную пробы инкубируют 24 часа, после чего производят регистрацию флюоресценции при длине волны возбуждения 325 нм и длине волны испускания 415 нм. Результаты представляют в условных единицах, стандартизованных на 1 мг белка. Известно, что усиление активности МАО в головном мозге, приводит к снижению содержания в ЦНС биогенных аминов - нейротрансмиттеров. Данный факт может говорить об ограничении стрессовой реакции. Активация МАО также способствует усилению продукции Н2О2, что естественно будет приводить к индукции оксидативного стресса. Следовательно, МАО можно рассматривать как метаболическое звено, осуществляющее взаимосвязь между обменом биогенных аминов и свободнорадикальным окислением. Существует тромбоцитарная форма МАО Б, идентичная по строению с церебральной МАО. Есть данные, что по уровню активности тромбоцитарной МАО можно определить уровень метаболизма биогенных аминов в ЦНС. Определение активности моноаминоксидазы-Б Принцип метода Активность моноаминоксидазы (МАО, аминкислородоксидоредуктазы (дезаминирующей, флавинсодержащей), К.Ф. 1.4.3.4.) определяли альдегидометрическим методом, используя, в качестве субстрата, бензиламина гидрохлорид, о дезаминировании которого судили по накоплению в среде бензальдегида. Для регистрации продукта реакции использовали принцип образования семикарбазона с последующей детекцией по поглощению при длине волны 278 нм. Используемые реактивы: 0,067М натрий-фосфатный буфер, рН=7,4 Среда выделения: 0,25М раствор сахарозы на буфере (1). 30,2мМ солянокислый бензиламин на буфере (1). 50 мМ раствор семикарбазида гидрохлорида в 0,6 Н хлорной кислоте. Термостат, центрифуга, спектрофотометр. Ход определения Экспериментальных животных забивают декапитацией, быстро извлекают головной мозг и печень, отмывают их в охлажденной среде выделения (2) и гомогенизируют в этой же среде. Следует готовить 3-6% гомогенат ткани печени и 10-25% гомогенат головного мозга. Гомогенаты центрифугируют при 1200g с целью удаления ядер и клеточных фрагментов. Супернатанты, используемые в качестве источника МАО, выдерживают в ледяной бане вплоть до определения ферментной активности. Ферментативную реакцию проводят в пробах объемом 3 мл. 0,2 мл "безъядерного" гомогената суспендируют в 2,3 мл 0.067М Na - фосфатного буфера и преинкубируют 20 минут при 37°С. Затем добавляют 0,5 мл раствора субстрата, тщательно перемешивают пробу стеклянной палочкой и инкубируют при 37°С в течение 90 минут. Реакцию останавливают внесением 1 мл раствора семикарбазида на хлорной кислоте. В качестве контроля ставится параллельная "слепая" проба, которую инкубируют без добавления субстрата, и вносят его после остановки реакции. Не менее чем через 30 минут после остановки ферментной реакции пробы освобождают от белкового осадка центрифугированием. Накопление бензальдегида в пробе оценивают по разнице оптических плотностей депротеинатов опытной и "слепой" проб при 278 нм (оптическую плотность регистрируют в слое 1 см против воды). Перерасчет в наномоли продукта осуществляют, исходя из тангенса угла наклона калибровочного графика (0,012), по формуле: ΔЕ(Еопыт-Еконтроль)/0,012. МАО-активность стандартизуют по количеству белка в пробе и выражают в наномолях продукта (бензальдегида) на 1 мг белка за 1 минуту. Ряд авторов предлагает использовать трибулиновую активность мочи человека как маркер стресса и тревоги, т.к. МАО-ингибиторное действие мочи нарастает в условиях психоэмоционального напряжения. Определение трибулиновой активности мочи Принцип метода базируется на установлении МАО – ингибиторной активности мочи [Error: Reference source not found]. В заранее приготовленной суспензии митохондрий, обладающей стабильной активностью МАО определяется активность фермента в присутствии исследуемого материала (моча). Используемые реактивы: Суспензия митохондрий печени крыс. Готовится на среде выделения, описанной выше. Гомогенат печени центрифугируют при 600 g 15 минут. Полученный супернатант центрифугируют 20 минут при 6500 g. Осадок ресуспендируют в исходном объеме среды выделения и повторно центрифугируют в том же режиме для освобождения от фрагментов органелл. Реактивы и оборудование для спектрофотометрического определения МАО Ход определения В пробирку вносят 0,1 - 0,2 мл свежеразмороженной суспензии митохондрий печени крысы, добавляют 0,02 мл мочи, доводят объем до 2,5 мл 0,067 М Na-фосфатным буфером (рН = 7,4), тщательно перемешивают стеклянной палочкой и преинкубируют в течение 20 минут при 37°С. Реакцию запускают внесением субстрата и производят определение МАО-активности. Длительность инкубации составляет 60 минут. В качестве контроля параллельно определяют МАО-активность митохондриального препарата без добавления мочи. Трибулиновая активность (ТА) мочи рассчитывается как процент угнетения МАО-активности митохондрий. Определение активности ксантиноксидазы (метод Hashimoto) Принцип метода заключается в регистрации скорости прироста концентрации продукта реакции – мочевой кислоты. В качестве субстрата используется ксантин. Количественное измерение содержание мочевой кислоты производят путем прямой УФ - фотометрии при длине волны 292 нм. Используемые реактивы: 0,3М фосфатный буфер рН 7,5 0,6 мМ оксонат калия 0,18 мМ ксантин (0,18ммоль/100 мл воды) Ход определения В контрольную и опытную пробы добавляют по 0,3 мл исследуемого образца, во все пробирки добавляется по 0,5 мл буфера и по 0,5 мл оксоната калия, в опытную пробу добавляют 1,0 мл раствора ксантина и 0,7 мл дистиллированной воды, а в контроль - только 1,7 мл дистиллированной воды, после чего все пробы инкубируют при 37°С в течение 30 мин. После инкубации во все пробирки добавляют по 1,2 мл 20 % ТХУ, перемешивают и центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость фотометрируют (опыт против контроля) при длине волны 292 нм. Перерасчет в единицы ферментативной активности производят исходя из построенного заранее калибровочного графика, с учетом времени инкубации и количества исследуемой ткани. Активность супероксиддисмутазы (метод С. Чевари и соавт.) Принцип методасостоит в способности СОД конкурировать с нитросиним тетразолием (НСТ) за супероксидные анионы, образующихся в результате аэробного взаимодействия НАД*Н и феназинметасульфата. Измерение содержания продуктов восстановления НСТ (нитроформазана) производят при длине волны 540 нм. Используемые реактивы: М Трис-ЭДТА – буфер Реагент I (Инкубационная смесь) (1 мкМ ЭДТА, 0,407 мМ НСТ, 1,8 мкМ феназинметасульфата) Реагент II (1 мМ раствор восстановленного НАД на буфере(2)) Абсолютный этанол Хлороформ Фотометр, центрифуга Ход определения К 0,5 мл гомогената исследуемой ткани (или 0,2 мл эритроцитарной массы) добавить 0,2 этанола и 0,1 хлороформа. Выдержать при постоянном помешивании 15 мин при 40С. Отцентрифугировать 10 минут 5000 об/мин, собрать супернатант. К 2,7 мл инкубационной смеси добавить 0,2 мл полученного супернатанта. Фотометрировать полученный образец при 540 нм против воды. Добавить 0,15 мл реактива II. Инкубация 10 минут в темном месте. Произвести второе измерение. Параллельно готовят контрольную пробу, в которую вместо исследуемого образца добавляют 0,2 мл этанола. Расчет:  Определение активности глутатионпероксидазы Принцип метода заключается в регистрации скорости накопления окисленного глутатиона. Определение активности глутатионпероксидазы в гемолизатах эритроцитов проводили по методу, описанному Власовой С.Н., Шабуниной Е.И., Переслегиной И.А. Реактивы, ход определения: В состав инкубационной смеси входили: 1,0 мл 0,3 М фосфатного буфера с рН 7,4(с азидом натрия 12 мМ и ЭДТА 6 мМ), 0,5 мл 2,5 мМ глутатиона восстановленного 0,2 мл гемолизата (1:40) или другого исследуемого образца, 0,5 мл 1,8 мМ перекиси водорода. Реакцию запускали внесением перекиси водорода, останавливали – 1,0 мл 10% ТХУ через 2 минуты. После центрифугирования при 3000 об/мин 15 мин, в депротеинатах определяли поглощение восстановленного глутатиона при 260 нм. Активность выражалась в мкМ окисленного глутатиона на 1 г гемоглобина (или ткани, или белка) в минуту. Активность каталазы (метод М.А. Королюк и соавт.) Принцип метода Метод основан на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс. Спектрофотометрирование образовавшегося комплекса производится при длине волны 410 нм. Ход определения, реактивы Реакция запускается добавлением 0,1 мл изучаемого образца к 2 мл 0,03 % раствора перекиси водорода. В холостую пробу вместо сыворотки вносят 0,1 мл дистиллированной воды. Реакцию останавливают через 10 минут добавлением 1 мл 4% молибдата аммония. Интенсивность окраски измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм против контрольной пробы, в которой вместо перекиси водорода вносят 2 мл воды. Расчет: Е = (Ехол-Eоп)×V×t×K (мкат/л), где Е – активность каталазы в мкат/л; А – оптическая плотность холостой и опытной проб; V – объем вносимой пробы, 0,1 мл; t – время инкубации, 600 сек; К – коэффициент миллимолярной экстинкции перекиси водорода, равный 2,22*103 мМ-1*см-1. Содержание церулоплазмина Принцип метода базируется на окислении р-фенилендиамина при участии церулоплазмина. Ферментативную реакцию останавливают добавлением фтористого натрия. По оптической плотности образовавшихся продуктов судят об уровне церулоплазмина. Содержание церулоплазмина в сыворотке крови изучали модифицированным методом Равина. Используемые реактивы: Водный раствор солянокислого р-фенилендиамина, 5 г/л Ацетатный буфер, рН 5,5 Раствор фтористого натрия, 30 г/л Ход определения В пробирки вносят по 0,1 мл исследуемого материала. В одну из пробирок, служащую контрольной, сразу добавляют 2,0 мл фтористого натрия (инактивация ферментативной активности церулоплазмина). Затем во все пробирки добавляют по 8,0 мл ацетатного буфера и по 1,0 р-фенилендиамина (используемого в качестве субстрата). Пробирки встряхивают и ставят на 1 час в термостат (37 0С). После инкубации во все пробирки, за исключением контрольной добавляют по 2,0 мл фтористого натрия. Содержимое пробирок перемешивают и выдерживают еще 30 мин при 40С. Пробы колориметрируют при длине волны 530 нм. Умножая полученные значения абсорбции на коэффициент 875, находят величину концентрации церулоплазмина в мг/л. Библиографический список Арутюнян, А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма // Методические рекомендации. - СПб.: ИКФ «Фолиант», 2000.-104 с. Балашов, Ю.Г. Флюорометрический микрометод определения кортикостероидов: сравнение с другими методами / Ю.Г. Балашов // Физиол. журн. СССР. – № 12. – С. 280–283. Волчегорский, И.А. Модифицированный метод спектрофотомет-рического определения активности моноаминоксидазы с бензиламином в качестве субстрата / И.А. Волчегорский, Н.А. Скобелева, Р.И. Лифшиц // Вопросы медицинской химии. 1991. – Т. 37, Вып. 1. – С. 86–89. Волчегорский, И.А. Экспериментальное моделирование и лабораторная оценка адаптационных реакций организма / И.А. Волчегорский, И.И. Долгушин, О.Л. Колесников, В.Э. Цейликман. – Челябинск, 2000. – 167 с. Волчегорский, И.А., Сравнительный анализ моноаминооксидазы - Б и ферментов антиокислительной защиты в различных отделах головного мозга человека. / И.А. Волчегорский, С.Е. Шемяков, В.В. Турыгин, Н.В. Малиновская / Бюлл. эксперимент. биол. и медицины.- Т132.- №8.- 2001 г. - С. 174. Горкин, В.З. Аминоксидазы и их значение в медицине. - М.: Медицина, 1981. - 335 с. Дубинина, Е.Е. Окислительная модификация белков / Е.Е. Дубинина, И.В. Шугалей // Успехи современной биологии. – 1993. – Т.113, №1. – С.71-81. Дубинина, Е.Е. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод её определения / Е.Е. Дубинина, С.О. Бурмистров, Д.А. Ходов и др. // Вопросы медицинской химии. – 1995. – № 41. – С. 24-26. Дубинина, Е.Е. Окислительная модификация белков: окисление триптофана и образование битирозина в очищенных белках с использованием системы Фентона / Е.Е. Дубинина, М.Г. Морозова, С.В. Гавровская и др. // Биохимия. —2002. —Т. 67, №3. —С. 413—421. Жуков, Д.А. Стрессореактивность и стратегия поведения крыс : автореферат дис. ... доктора биологических наук : 03.00.13. - Москва, 1999. - 36 с. Камышников, В. С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике. / В. С Камышников. – Москва, 2004. – 920 с. Королюк, М. А. Метод определения активности каталазы / М. А. Королюк, Л. И. Иванова, И. Г. Майорова // Лаб. дело. – 1988. – № 1. –С.16–19. Львовская Е.И., Волчегорский И.А., Шемяков С.Е. и др. Спектрофотометрическое определение конечных продуктов перекисного окисления липидов. Вопр. мед. химии 1991; 37:4:92-94. Синицкий, А.И. Особенности свободнорадикального окисления при гипо- и гиперкортикоидных состояниях : диссертация ... доктора медицинских наук : - Челябинск, 2013. - 298 с. : 11 ил. Филаретов, А.А. Принципы и механизмы регуляции гипофизарно -адренокортикальной системы / А.А. Филаретов. - Л.: Наука, 1987. - 164 с. Филаретов, А.А. Функциональное значение многозвенного построения гипоталамо – гипофизарно - нейроэндокринных систем / А.А. Филаретов // Успехи физиол. наук. - 1996. - т. 27, № 3. - С. 3 - 12. ГЛАВА 3. МЕТОДЫ ПРОФИЛАКТИКИ И ОПТИМИЗАЦИИ УРОВНЯ СТРЕССА 3.1. Аутогенная тренировка Истоки аутогенной тренировки восходят к практике индийский йогов, которые могли при помощи самовнушения влиять на многие психические и физиологические процессы своего организма. В настоящее время признано, что аутогенная тренировка (АТ) является достаточно эффективным приемом коррекции психоэмоционального напряжения и уровня стресса. Механизмы происходящих при этом явлений пока остаются неясными, а созданная еще в начале века «периферическая теория эмоций» Джеймса-Ланге до сих пор сохраняет свое значение для понимания процессов, связывающих наши мысли и наше тело. Согласно этой гипотезе, каждому физиологическому состоянию организма более или менее детерминировано соответствует определенное состояние сознания, причем влияние этих состояний зеркально взаимообразно. Из парадоксального на первый взгляд утверждения У. Джеймса «мы плачем не потому, что нам плохо, а нам плохо, потому что мы плачем» вытекает достаточно подтвержденный на практике эмпирический вывод. Если усилием воли изменить, во-первых, паттерн возбуждения скелетной мускулатуры, сделав его соответствующим другой эмоции, а во-вторых, свои мысли, сделав допущение, что нужная эмоция уже имеется в организме, то вероятность возникновения искомой эмоции резко возрастет. Примером первого из вышеназванных подходов по воздействию на собственное тело может служить метод Джекобсона, а образцом второго способа - метод Е. Куэ. В основе метода, предложенного Джекобсоном, лежит представление о том, что между мозгом и скелетными мышцами существует тесная взаимосвязь, при которой психическое напряжение тут же отражается в виде повышенного тонуса мускулатуры, а напряжение мышц усиливает эмоциональное напряжение. По мнению Джекобсона образующийся при этом порочный круг можно разорвать только с «периферического конца», то есть путем специальных упражнений, направленных на полное расслабление скелетной мускулатуры. Исходя из этого, автором была разработана техника произвольного расслабления мышц при аффективных состояниях (страх, тревога, смущение и т. д.), что способствовало снятию эмоциональной напряженности, а так же использовалось для предупреждения возникновения этих состояний. В отличие от метода мышечной релаксации, в котором имеет место косвенное влияние мышц на сознание человека, предложенный более ста лет назад метод Куэ предполагает прямое воздействие на настроение и эмоции человека путем сознательного формирования соответствующих мысленных образов. Для этого человек должен представить, что зачатки нужной эмоции (спокойствия, радости и т. д.) уже есть в организме и внушать себе, что сила этих чувств постепенно нарастает. В принципе, достаточно несколько десятков раз повторить фразу «Я чувствую себя хорошо», сопровождая эти слова яркими и детальными представлениями, как бывает вам хорошо, чтобы ваше состояние на самом деле улучшилось. Куэ рекомендовал делать подобные упражнения дважды в день — утром (сразу после пробуждения) и вечером (перед засыпаением). В 1930-х годах Иоганн Шульц, проинтегрировав опыт как западной, так и восточной психотерапии (в частности, систему йогов), создал свое направление самовнушения, назвав его аутогенной тренировкой (АТ). Упражнения АТ, по Шульцу, разделяются на две ступени — начальную и высшую. В начальную ступень входят 6 упражнений, благодаря которым можно научиться произвольно влиять на ряд процессов организма, в норме не подчиняющихся сознательному контролю. Итогом этого этапа АТ являются шесть навыков: - вызывать ощущение тяжести в конечностях; - вызывать ощущение тепла в конечностях; - нормализировать ритм сердечной деятельности - нормализировать ритм дыхания; - вызывать ощущение тепла в эпигастральной области; - вызывать ощущение прохлады в области лба. Эта каноническая последовательность упражнений неоднократно подвергалась модификациям различными авторами. Тем не менее главная идея И. Шульца о сознательном управлении тонусом скелетной мускулатуры и стенок кровеносных сосудов с помощью словесных формул и зрительных образов присутствует во всех модификациях АТ. Высшая ступень аутотренинга Шульца фактически являлась модифицированным вариантом раджи-йоги и была доступна лишь отдельным пациентам. На этой ступени люди обучались вызывать у себя «особые душевные состояния» (в отличие от низшей ступени, на которой, по Шульцу, вызываются «изменения соматического характера»). Пациенты, осваивающие классический вариант АТ, на данном этапе последовательно обучались способности ярко представлять перед внутренним взором вначале какой-нибудь цвет, затем заданный объект и, наконец, представлять себе образы абстрактных понятий («красоты», «счастья», «справедливости» и т. п.). В заключение занимающиеся АТ, находясь в состоянии глубокого погружения, задают себе вопросы типа «В чем смысл работы?», получая ответ на них в виде зрительных образов. К настоящему времени аутогенная тренировка полностью прошла практическую апробацию и широко используется в медицине, психотерапии, спорте, военном деле, педагогике и других областях человеческой практики. Как отмечают многие специалисты, обстановка и особый психологический настрой, свойственный занятиям аутогенной тренировкой, внушенное состояние покоя и мышечного расслабления способствуют уменьшению эмоционального напряжения, свойственного людям с повышенной тревожностью и склонным к переживанию стрессов. Эта важная особенность самовнушения может быть использована для того, чтобы устранить тревогу, беспокойство, страх, чрезмерную эмоциональную напряженность. Аутогенная тренировка |