Издательский дом Питер
 Скачать 5.79 Mb.
|
|
Исследование поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg). Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) — метод выбора для скри-нинга донорской крови на HBsAg. В ИФА используется твердая подложка (например, микропланшет, шарик или пластинка), покрытая немеченной антисывороткой против соответствующего антигена. В качестве индикаторного материала используется такое же антитело, маркированное ферментом, присутствие которого может быть зарегистрировано по изменению окраски субстрата. Если образец содержит антиген, то последний будет связываться с антителом, фиксированным на твердой фазе, а с другой стороны, будет связываться с меченным ферментом индикаторным антителом. Посттрансфузионные гепатиты__________________________661 Высокая чувствительность ИФА обусловливает полезность этого метода для массового скрининга, однако одновременно создает возможность ложно-положительных реакций. До признания донора антиген-положительным, что имеет значительные клинические и социальные последствия и вызывает бессрочное отстранение от донорства, важно определить, действительно ли результат скрининга воспроизводим. Если начальный тест повторен в дубле и один из двух повторных тестов реактивен, образец квалифицируется как повторно реактивный и доза крови (ее компоненты) должна быть забракована. Совершенствование ИФА-диагностики ВГВ связано с разработкой систем, позволяющих выявить мутантные варианты HBs-антигена. Реакция нейтрализации для подтверждения результатов ИФА. Проведение подтверждающих исследований не обязательно, однако общепринято повторно выполнять дополнительное исследование реактивных образцов в ИФА. В подтверждающих тестах с нейтрализацией реактивный образец инкубируется с человеческой сывороткой, заведомо содержащей антитела, специфичные к искомому антигену. Если при этом положительная реакция исчезнет или выраженность ее сократится не менее чем на 50 %, а контрольные образцы реагируют, как и ожидалось, присутствие антигена подтверждается и исходный результат расценивают как истинно положительный. Если инкубация с известным антителом даже частично не влияет на реактивность, то первичный результат расценивается как ложноположительный. Параллельно с образцами крови донора или пациента должны тестироваться известные положительный и отрицательный контрольные образцы. Необходимо параллельно выполнять исследование с препаратом, заведомо содержащим антитела, специфичные к искомому антигену, и с препаратом, заведомо свободным как от антигена, так и от антител. Значения положительного и отрицательного контрольных образцов должны вписываться в регламентированные границы. Если процент нейтрализации не соответствует указанному в инструкции к набору, исследование следует повторить. Твердофазный иммуноферментный анализ для скрининга антител к вирусам. Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) — метод, широко применяемый для скрининга на наличие антител к ВИЧ и ВГС. Для скрининга антител используется твердая подложка (микропланшет, шарик или пластинка), покрытая антигеном, приготовленным из рекомбинантных белков соответствующего вируса или синтетических пептидов. В большинстве ди-агностикумов используется принцип захвата. Сыворотка или плазма инкубируется с фиксированным антигеном; при наличии антител они прочно свя^ зываются с твердой фазой и остаются в этом состоянии после отмывания всей жидкой фазы. Затем добавляется конъюгированный с ферментом препарат антигена; если фиксированные антитела присутствуют — они связываются с меченным антигеном с образованием комплексов «антиген-антитело», кото- 662__________Глава 15. Гемотрансмиссивные инфекции и их профилактика рые могут быть определены путем измерения ферментативной активности. В ряде диагностикумов используется принцип конкуренции. Специфические антитела, присутствующие в образце, будут конкурировать с антителами, конъ-югированными с ферментом, тем самым уменьшая уровень активности фиксированного фермента по сравнению с результатами, полученными в присутствии нереактивного материала. Исследование антител к вирусу гепатита С. Антитела к ВГС остаются единственным специфическим критерием этой инфекции, используемым в службе крови*. Сама по себе природа антигена (рекомбинантный или синтетический) чувствительность тест-системы не определяет. Выбор наиболее чувствительных тест-систем для скрининга доноров гемокомпонентов является актуальной научно-практической задачей. Антитела к ВГС, как правило, определяются спустя 2 мес после инфици-рования, но могут и не появляться в течение 3-6 мес. Закономерности гуморального иммунного ответа при ВГС-инфекции во многом не изучены. Наряду с достижениями в профилактике гепатита С сохраняются некоторые проблемы. Сроки появления антител к белкам ВГС весьма вариабель-ны. Как методы скрининга, так и подтверждающие методы могут давать лож-ноположительные и ложноотрицательные результаты. В силу этого положительный результат скрининга на анти-ВГС-антитела служит основанием для выбраковывания донорской крови и углубленного обследования донора. Для обследования донорской крови целесообразно использовать тест-системы, в которых имеется возможность выявления антител классов IgG и IgM к структурным и неструктурным антигенам ВГС**. Образцы, дающие отрицательные результаты при скрининговом исследовании (в соответствии с инструкцией к диагностикуму), квалифицируются как отрицательные и не нуждаются в дальнейшем изучении. Образцы, дающие положительные результаты в первичном скрининговом определении, целесообразно повторно исследовать с использованием двух диагностику мов. Позитивная реакция в обоих повторных исследованиях или одном из них означает положительный результат. Если в обоих повторных тестах позитивная реакция не выявлена, результат расценивается как отрицательный. * Появились сообщения об использовании для обследования доноров тест-системы для выявления core-антигена вируса гепатита С (Ortho Diagnostics, США), что в некоторых случаях позволяет выявить инфицированных лиц до сероконверсии. A. Brojer и соавт. (2001) среди 144 тыс. обследованных доноров обнаружили только двух лиц с отсутствием антител к ВГС и наличием РНК ВГС. В обоих случаях параллельно выявлялся core-антиген. ** Совершенствование ИФА-диагностики ВГС связано с разработкой тест-систем четвертого поколения, в которые включены два новых антигена: NS3/4a и MEFA 7.1. Посттрансфузионные гепатиты вез При выявлении позитивной реакции образцов в первичном скрининговом исследовании доза донорской крови помещается на карантинное хранение до тех пор, пока не станут известны результаты двойного повторного исследования. Все образцы крови и ее компонентов от «положительной» донации должны быть уничтожены. Факт уничтожения регистрируется документально. Целесообразно, хотя и не обязательно, проведение дополнительного или подтверждающего изучения образцов с положительным результатом. Выбор диагностикума оптимально определять в зависимости от количества образцов, подлежащих исследованию (цельные микропланшеты — на 90-92 определения; стриповые тест-системы — на 4-24 определения). При необходимости срочного исследования 1-3 образцов целесообразно использовать тест-систему, позволяющую провести индивидуальное исследование («Имму-ноКомб»; «Биоград», Санкт-Петербург) (подробнее см. раздел 15.3.2.). Современные лаборатории ИФА оснащаются комплектом аппаратуры, позволяющей выполнять широкий спектр исследований, создавать базы данных и управлять ими. В практике обследования доноров крови хорошо зарекомендовал себя информационно-измерительный комплекс «ИЛИП» (Санкт-Петербург). До венепункции донору разъясняют порядок действий учреждения с положительным результатом исследований. О любом отклонении, выявленном при лабораторном обследовании, целесообразно информировать доноров. Определение других маркеров вирусных гепатитов при первичном обследовании доноров нецелесообразно. При неблагоприятной эпидемической обстановке в регионе (области, городе) соответствующие местные органы здравоохранения могут принять решение о расширении перечня параметров лабораторного обследования донорской крови, что связано с дополнительными расходами, трудозатратами и сокращением донорского контингента. Исследование антител к цитомегаловирусу. Цитомегаловирус (ЦМВ) обладает способностью персистировать в тканях и лейкоцитах в течение ряда лет после первичного инфицирования. Не содержащая антител к вирусу кровь не несет в себе риска передачи инфекции. Некоторые категории пациентов с иммунодефицитом должны быть защищены от возможного инфицирования или реинфицирования ЦМВ. Для этого целесообразно отобрать анти-ЦМВ-отрицательных доноров для приготовления клеточных компонентов крови. Исследование анти-ЦМВ не является обязательным, однако при его выполнении применяются обычные правила контроля. Для определения антител может быть использован твердофазный имму-ноферментный анализ, аналогично описанному для анти-ВГС. В инструкции к набору указано, можно ли с его использованием раздельно определить IgM-и IgG-антитела к вирусу. Другим путем профилактики посттрансфузионной ЦМВ-инфекции (и других вирусных инфекций, возбудители которых персистируют в лейкоци- 664 ____Глава 15. Гемотрансмиссивные инфекции и их профилактика тах) является удаление лейкоцитов из клеточных компонентов крови. С этой целью можно использовать центрифугирование с удалением лейкоцитарного слоя, отмывание свежих и криоконсервированных эритроцитов, специальные лейкоцитарные фильтры. Подробнее см. раздел 15.3.3. Суррогатные маркеры вирусных гепатитов. Суррогатные маркеры — неспецифические маркеры, дополняющие специфические тесты выявления возбудителя инфекционного заболевания. Тестирование донорской крови на наличие суррогатных маркеров вирусных гепатитов было предложено до разработки и внедрения в производство специфических диагностикумов. По мере совершенствования специфических диагностикумов значимость исследования суррогатных маркеров вирусных гепатитов у доноров снижается. Аланинаминотрансфераза (АЛТ, или АлАТ, — фермент, катализирующий процесс переаминирования, т. е. обратимого переноса аминогруппы с L-ала-нина на а-кетоглутаровую кислоту; ранее назывался сывороточной глутамат-пируваттрансаминазой, или SGPT). Данный фермент присутствует во многих тканях организма, в частности в печени. В гепатоцитах он локализуется в цитоплазме клеток. Высвобождение АЛТ в кровь происходит при повышении проницаемости клеточных мембран, что свойственно как острому вирусному гепатиту, так и рецидивам хронического гепатита. В связи с этим АЛТ считается «индикаторным ферментом» и к его определению прибегают постоянно при постановке диагноза гепатитов любой природы. Повышение активности АЛТ в циркулирующей крови встречается при различного рода поражениях печени, включая вирусную инфекцию, заболевания желчевыводя-щих путей, токсичность лекарств и алкоголя.темохроматоз и ожирение. Методы исследования АЛТ основаны на определении скорости образования пировиноградной кислоты. Наиболее распространенными являются спек-трофотометрический и колориметрический методы. Колориметрический метод (динитрофенилгидразиновый) основан на определении окрашенного комплекса пировиноградной кислоты. Нормальные величины активности фермента — 0,1-0,68 ммоль/ч/л, коэффициент вариации метода — 2-6 %. Пробы сыворотки крови можно хранить до 5 сут при температуре 2-8 °С. Спектрофотометрические методы основаны на принципе разницы поглощения при определенной длине волны восстановленной и окисленной форм никотинамидадениндинуклеотида. Преимущество метода состоит в возможности прямого измерения скорости ферментативной реакции. Нормальные величины АЛТ составляют от 2 до 50 МЕ/л (в зависимости от модификации метода), коэффициент вариации метода — 2-6 %. В настоящее время определение уровня активности АЛТ при обследовании доноров крови и ее компонентов обязательно. Установлено более частое (в 10-12 раз) выявление среди сывороток крови с повышенным уровнем Постгрансфузионные гепатиты 665 активности АЛТ анти-ВГС. Кроме того, повышение уровня активности АЛТ может свидетельствовать о наличии других гепатотропных вирусов, передающихся с кровью, сниженном («подпороговом», неулавливаемом) содержании специфического маркера либо его отсутствие в серонегативном периоде (периоде «окна»). В перспективе с внедрением в практику работы службы крови специфических диагностикумов повышенной чувствительности исследование уровня активности АЛТ у доноров может быть признано необязательным (в США - с 1996 г.). С внедрением в практику службы крови исследования активности АЛТ утратило свою значимость определение содержания билирубина в качестве суррогатного маркера безжелтушной формы вирусных гепатитов. Исследование донорской крови на содержание билирубина проводить не следует. В ряде стран в качестве суррогатного маркера гепатита «ни А, ни В» было внедрено определение анти-НВс, которое с внедрением обследования доноров на анти-ВГС утратило свою значимость и проводить его не следует. Ни в одном из образцов крови с изолированным наличием анти-НВс IgG не удалось обнаружить ДНК ВГВ. Более того, М. С. Мооге и соавт. (1997) показывают, что анти-НВс-положительные доноры обладают особой ценностью, поскольку их значительная доля содержит и анти-HBs — источник сырья для производства специфического иммуноглобулина. Аннулирование результатов исследования маркеров вирусных инфекций. Результаты исследования _маркеров вирусных инфекций могут быть признаны несостоятельными в случае несоответствия инструкции производителя (например, повреждение упаковки, истечение срока годности, нарушение порядка выполнения исследования, испорченные реагенты) или если результаты контрольных образцов не соответствуют критериям, указанным в инструкции к диагностикуму. При аннулировании результатов исследования со всеми образцами и контрольными образцами аннулированного теста выполняется новое исследование, данные которого трактуются как результаты первичного регистрируемого теста. До аннулирования результатов исследования выявленные проблемы должны быть рассмотрены руководителем учреждения (отдела контроля качества), причины ошибок проанализированы и при необходимости предприняты меры по их исправлению. При аннулировании результатов исследования составляется протокол о нарушении стандартного производственного процесса с полным описанием причин нарушения и принятых мер. Использование внешних контрольных образцов для исследования маркеров вирусных инфекций. Внутренние (включенные в состав тест-системы) контрольные образцы, подтверждающие достоверность исследования, поставляются вместе с диагностическим набором; их использование предназначено для демонстрации предписанного хода выполнения анализа. Внешние (арбитражные) контрольные образцы — реагенты, приобретаемые коммерчес- 666__________Глава 15. Гемотрансмиссивные инфекции и их профилактика ким путем или специально полученные, используются в качестве дополнения к указаниям инструкции производителя для усиления мероприятий по обеспечению безопасности крови и повышения бдительности в отношении возможной ошибки. На основании результатов исследования внешних контрольных образцов можно аннулировать отрицательные результаты исследования, однако если последнее выполнено в соответствии с инструкциями производителей, а внутренние контрольные образцы сработали, то внешние контрольные образцы не могут быть использованы для аннулирования положительных результатов. О программах контроля качества см. также разделы 15.3.2. и 15.4. 15.2.5. Профилактика посттрансфузионных гепатитов при заготовке и хранении гемотрансфузионных средств За соблюдение принципов инфекционной безопасности обследования доноров, заготовки и консервирования донорской крови, фракционирования крови на компоненты и препараты, а также проведение гемотрансфузий несут ответственность как руководители, так и персонал учреждений службы крови (статья 16 Закона РФ «О донорстве крови и ее компонентов» № 5142-1 от 9 июня 1993г.). 15.2.5.1. Подготовка персонала Условиями обеспечения безопасности являются четкое исполнение письменного регламента функциональных обязанностей каждого сотрудника, плановая специальная подготовка, периодический (не реже одного раза в год) инструктаж и контроль правильности выполнения операций. Программы специальной подготовки должны быть адаптированы к различным категориям персонала учреждения службы крови, включать требования действующих официальных документов. Программа подготовки по производственной безопасности для всех сотрудников должна предусматривать изучение следующих разделов: — требования руководящих документов; — требования функциональных обязанностей; — механизмы передачи вирусов гепатитов и ВИЧ с кровью, начальные симптомы, клинические проявления и последствия этих инфекций; — особенности выполнения производственных операций с потенциальным риском инфицирования; — организация и оснащение рабочих мест, использование защитной одежды и оснащения для выполняемых процедур. Следует обращать внимание на ограниченность возможностей защитной одежды и оснащения, а также на недопустимость ложного чувства безопасности. Постгрансфузионные гепатиты __ __ 667 Кроме того, подготовка сотрудников по производственной безопасности имеет целью выработку навыков: — правильного использования защитной одежды и оснащения, обеззараживания и уничтожения инфицированного материала; — действий в случае попадания крови или других потенциально инфекционных материалов на незащищенные участки тела; — действий в случаях проливания крови или ее компонентов на любом этапе работы с ними, а также воздействия на людей жидкостей, тканей, загрязненных инструментов. Вновь принятые сотрудники должны быть до начала работы ознакомлены с правилами техники безопасности и пройти подготовку по их соблюдению. До направления на самостоятельную работу подготовленность сотрудника и его способность применять все необходимые меры предосторожности документируется руководителем. Дополнительная подготовка по технике безопасности проводится при перемещении или временном назначении сотрудников на другой участок работы. Соблюдение сотрудником правил техники безопасности — важнейший критерий оценки качества работы. Руководители обязаны пресекать нарушения правил техники безопасности. О каждом нарушении и принятых мерах целесообразно сообщать персоналу учреждения службы крови. |