Рататуй. Навчальний посібник для студентів, що навчаються у вищих навчальних закладах іii1V рівнів акредитації за напрямом Ветеринарна медицина
 Скачать 5.29 Mb.
|
|
Біохімічні ознаки патогенних, повільноростущих мікобактерій Активність М. mаrіnum М. tuberculos M. bovis М. аvium M. kansasіі М. scrofulaceu уреаза + + + - + + піразинамідаза ( і) + + - + ± + кисла фосфатаза + + + - + - відновлення нітратів - + - - + ± α-естераза - + + + - ± каталаза ± - - ± + + акумуляція ніацина - + - - - гідроліз твіну ( 10 іб) + ± - - + - Морфологія і тинкторіальні властивості. Тонкі, прямі чи злегка вигнуті палички розмірами 1-10х0,2-0,6 мкм, зі злегка закругленими кінцями; у цитоплазмі містять зернисті утворення (2- 10). Морфологія істотно варіює в залежності від віку культури й умов культивування — у молодих культурах палички більш довгі, а в старих схильні до простого розгалуження. Іноді утворять коковидні структури і L-форми, що зберігають інфекційність, а також фільтрівні форми, патогенетична роль яких залишається погано вивченою. Нерухомі, спор не утворюють, позбавлені капсул, але мають мікрокапсулу, відділену від клітинної стінки осмієфобною зоною. Кислоторезистентні, що обумовлено високим вмістом ліпідів і 413 міколової кислоти в клітинній стінці, а також утворюють кислотолабільні гранули, що переважно складаються з метафосфату (зерна Муха), що розташовуються вільно або в цитоплазмі паличок. Грампозитивні, анілінові барвники сприймають погано; по Цілю— Нільсену зафарбовуються в яскраво-червоний колір, по Муху-Вайссу — у фіолетовий (йодофільність); гранули також фарбуються у відповідний колір. Культуральні властивості. Аероби, але здатні рости факультативно у анаеробних умовах; вміст 5-10% СО 2 сприяє більш швидкому росту. Розмножуються поділом, процес проходить дуже повільно, у середньому за 14-18 год. Температурний оптимум 37-38 °С; рН 7,0-7,2 (росте в межах 4,5-8,0). Для росту потребують присутності білкового субстрату і гліцерину, а також вуглецю, хлору, сірки, фосфору, азоту, факторів росту (біотину, нікотинової кислоти, рибофлавіну й ін.), іонів (Mg 2+ , К + , Na + , Fe 2+ ). Для вирощування найбільше часто використовують щільні яєчні середовища (Левенштейна—Йенсена, Петраньяні, Дорсе й ін.), синтетичні і напівсинтетичні рідкі середовища (наприклад, середовище Сотона) і ін. На рідких середовищах ріст спостерігають на 5-7 добу у виді сухої зморшкуватої плівки (R-форма), що піднімається на краї пробірки; середовище залишається прозорим. У середовищах, що містять детергент (твін-80), дають рівномірний ріст по товщі середовища (особливо при періодичному струшуванні). На рідких середовищах і при внутрішньоклітинному розвитку добре виявляється характерний корд-фактор (трегалоза-6,6-дімиколат), що обумовлює зближення бактеріальних клітин у мікроколоніях, їх ріст у виді серпантиноподібних кіс, що має відношення до вірулентності збудника. На щільних середовищах ріст відзначають на 14-40 добу у 414 виді сухого зморшкуватого нальоту кремового кольору; колонії з піднятим центром, що нагадують кольорову капусту, крихкі, погано змочуються водою і мають приємний аромат. Культури погано знімаються із середовища, а при прожарюванні тріскотять. Під впливом антибактеріальних препаратів можуть дисоціювати з утворенням м'ягких вологих S-колоній або рости у виді гладких чи пігментних колоній. Відмінна риса Mycobacterium tuberculosis — здатність до синтезу значної кількості нікотинової кислоти (ніацина), що використовують для її диференціальної діагностики з іншими мікобактеріями (ніациновий тест); одне з умов — необхідність посіву на середовище Левенштейна—Йенсена, яке не містить малахітового зеленого (тому що барвник вступає в реакцію з використовуваними реагентами). На середовищах із жовчю утворюють сіруватий маслянистий наліт, утворений подовженими розгалуженими паличками. Резистентність. Паличка Коха досить стійка до різних впливів: у молоці гине через 15-20 хв при температурі 60° С; при аналогічній температурі в мокротинні зберігається до години; при кип'ятінні гине через 5 хв. Пряме сонячне світло убиває паличку Коха через 45-55 хв, розсіяний світло — через 8-10 діб. Добре зберігається при висушувані (до декількох тижнів). Звичайні хімічні дезінфектанти відносно мало ефективні; 5% розчин фенолу убиває Mycobacterium tubercuhsis лише через 5-6 год; збудник також здатний швидко виробляти стійкість до більшості антибактеріальних засобів. Збудник туберкульозу 415 Туберкульоз (Tuberculosis) інфекційне захворювання людини і тварин, яке частіше перебігає хронічно й характеризується утворенням у внутрішніх органах і тканинах типових вузликів— туберкулів, схильних до казеозного переродження. Туберкульоз людству відомий з давніх часів, проте його природа поступово з'ясовувалася, починаючи з середини XIX століття. В 1896 р. Леман і Нойман віднесли збудника туберкульозу до роду Mycobacterium. Мікобактерії віднесені до порядку Actinomycetales, родина Муcobacteriaceae. Рід Mycobacterium об'єднує близько 40 видів. Збудник туберкульозу має три основних види: Mycobacterium tuberculosis, M. bovis, М. avium а також M. murium, M. poykilothermorum. У «Визначнику бактерій» Берджі (1997) відносяться до Групи 21 «Мікобактерії». Морфологія. M. tuberculosis — прямі або злегка зігнуті палички довжиною 1—6 і шириною 0,3—0,6 мкм ( рис.18). Зустрічаються дуже короткі або видовжені й навіть гіллясті форми. Рис.18. M. tuberculosis. Скануюча ЕМ (за Денніс Канкель, 416 2004 р.). M. bovis— дещо коротші прямі або злегка зігнуті палички довжиною 1,5—2 і шириною 0,3—0,6мкм. Цей вид є основним збудником туберкульозу у великої рогатої худоби, інших жуйних, рідше уражує людей, м'ясоїдних тварин і деякі види птиці. М. avium — основний збудник туберкульозу птахів, інколи викликає захворювання у свиней і великої рогатої худоби. У нього ви- ражений поліморфізм: поряд з тонкими прямими або зігнутими па- личками мікобактерій туберкульозу зустрічаються кокоподібні й нитчасті форми (рис. 19). За даними професора Власенка В.В. для збудника туберкульозу є закономірний біологічний цикл його розвитку: артроспори, дроблення, ділення та інші, що визначає значний поліморфізм їх в процесі росту та розвитку і вимагає від дослідника особливої уваги під час інрерпритації результатів мікроскопічного дослідження відповідних матеріалів. Збудник туберкульозу, як і інші мікобактерії, кислото- та спирто- стійкий, фарбується позитивно за Грамом, нерухливий, не утворює cпoр i капсул. Добре фарбується за методом Ціль-Нільсена; при цьому фіксований на полум’ї мазок фарбують карболовим фуксином Ціля з підігріванням до відходження пари протягом 3 хв, промивають водою і знебарвлюють 3—5 %- ним розчином сірчаної кислоти 5—7 с, промивають водою, додатково обробляють 70—90 %-ним етанолом протягом 3—5 с, промивають водою і фарбують контрастно метилено- вою синькою Лефлера близько 1 хв. Промитий мазок висушують. Мікобактерії, проявляючи стійкість проти кислоти і спирту, зберігають червоний колір, інші бактерії і клітини патологічного 417 матеріалу - сині. Рис. 19. M. avium. Скануюча ЕМ (за Денніс Канкель, 2004 р.). Здатність мікобактерій протистояти короткочасному впливу мінеральних кислот, спиртів, антиформіну пояснюється в основному їх хімічною структурою. Зокрема, мікобактерії туберкульозу відрізня- ються високим вмістом ліпідів, на частку яких припадає 10—40 % сухої мікробної маси. До складу ліпідів входять віск (5—12 %), нейт- ральні жири і фосфатиди, які імпрегнують бактеріальні клітини й на- дають їм гідрофобності. Крім того, віск містить значну кількість міколових кислот, які з основними фарбами утворюють міцну сполуку, стійку проти кислот і деяких інших хімічних речовин. Збудник туберкульозу нерівномірно сприймає фарби, в зв'язку з чим має зернистий вигляд. В цитоплазмі знаходять різні за формою і величиною включення, названі зернами Муха. Крім цитоплазми їх можна виявити поряд з клітинами і навіть в мазках із патологічного матеріалу. В цитоплазмі туберкульозних мікобактерій можна виявити також 418 кілька вакуолей. Бактерії туберкульозу здатні утворювати дефектні щодо клітинної стінки форми, або такі, які повністю її втратили (L- форми). Останні можуть тривалий час існувати в організмі і реверсувати у початковий стан як тільки припиниться вплив трансформуючого фактора (антибіотиків, поверхнево активних речовин типу гліцину, лізоциму, мікобактеріофага). L-форми зберігають антигенність і під їх впливом утворюються антитіла. Однак патогенність цих форм порівняно з початковим типом значно нижча і при зараженні морських свинок розвивається в'ялий туберкульозний процес. Культуральні властивості. Збудники туберкульозу культивуються на елективних живильних середовищах в аеробних умовах. М. bovis — мікроаерофіл і при пересівах він легко адаптується до росту в аеробних умовах. Оптимальна температура росту для М. tuberculosis 37—38 °С, М. bovis — 38—39, М. avium — 39—41 °С, з оптимальною рН для усіх видів 6,8—7,4. Збудники туберкульозу дуже вибагливі до живильних середовищ. Останні повинні містити мінеральні солі, амінокислоти, фактори росту, деякі інші речовини й обов'язково гліцерин як джерело вуглецю (гліцеринові МПБ, МПА, картопля). Для приготування елективного середовища Левенштейна — Ієнсена беруть 1 л яєчної маси (вміст яєць асептично виливають у колбу з бусами), 600 мл сольового розчину, до складу якого входять калій однозаміщений фосфорнокислий 2,4 г, магній сірчанокислий — 0,24, магній лимоннокислий — 0,6, L-аспарагін — 3,6 г, гліцерин — 12 мл, вода дистильована — 600 мл, додають 30 г картопляного бо- рошна і 20 мл 2 %-ного стерильного розчину малахітової зелені. Со- льовий розчин стерилізують, в автоклаві при 1,5 атм. протягом 30 хв, 419 після охолодження до нього додають стерильне картопляне борошно, яєчну масу й розчин малахітової зелені, фільтрують через паперовий фільтр, розливають у пробірки й піддають згортанню в нахиленому положенні при температурі 85 °С протягом 30 хв. Широко застосовують також елективні середовища Гельберга, Петраньяні, Мордовського та інші, а також синтетичні — Сотона, Моделя та інші, рецептура яких і спосіб приготування описані в спеціальних довідниках. На щільних живильних середовищах М. tuberculosis (рис. 20), на 20— 30-ту добу після посіву утворює бородавчасті колонії (R-форма), рід- ше — з рівними краями і поверхнею (S-форма). У рідких середовищах на 15—30 -ту добу на поверхні утворюється потовщена зморщена плівка, краї якої дещо завертаються на стінки колби. Інколи на дні її помітні дрібні крупинки, рідина в усіх випадках прозора. M. bovis пpи первинному виділенні на щільних середовищах росте погано й перші ознаки росту з’являються лише через 30— 60 діб. Поступово формуються дрібні, круглі, вологі, майже прозорі колонії. Особливістю цього виду є те, що гліцерин затримує його ріст, у зв'яз- ку з чим на яєчних середовищах з гліцерином він росте, дуже погано, або й не розвивається зовсім. За рахунок мікроаерофільності в напіврідких середовищах колонії утворюються на глибині 9—20 см від поверхні. В рідких середовищах М. bovis утворює тонку, інколи сітчасту плівку, яка не покриває всієї поверхні рідини. 420 Рис. 20. Ріст мікобактерій на середовищі Петраньяні. М. avium росте порівняно швидше. Починаючи з 20-ї доби, можна помітити утворення гладеньких, блискучих сірувато-білого або жовтуватого кольору кратероподібних колоній. Нерідко формується суцільне вологе ослизле нашарування. У рідких середовищах на дні пробірки колонії мають вигляд ватоподібного осаду. В інших випадках на поверхні середовища виникає спочатку суха, потім ос- лизла суцільна плівка. Відомі також середовища, що «прискорюють» ріст збудника туберкульозу (Власенко В.В., 2002). Помітний ріст його можна спостерігати вже через декілька днів після посіву. Антигенна структура. Для всіх мікобактерій спільним є термостабільний антиген поліцукридної природи. Кожен вид збудника туберкульозу має від 4—6 до 8—10 антигенних компонентів, серед яких є і групові. Зокрема, М. avium має 4, сапрофітні мікобактерії — 2—3 антигени, ідентичні з антигенами М. bovis. Це в значній мірі ускладнює імунологічну діагностику туберкульозу через групові реак- ції. Незважаючи на спільність антигенних комплексів, виявилося, що окремі антигени мікобактерій різняться між собою за кількісною і 421 якісною структурою хімічних речовин. Резистентність. Збудник туберкульозу у зовнішньому середовищі надзвичайно стійкий. В ґрунті зберігає життєздатність протягом 13 міс, в глибших шарах не лише виживає, а й зберігає високу патогенність для кролів протягом 18 міс. У відкритих водоймах зберігається не більше 12 днів. У воді, що знаходиться у приміщені і в повітрі при розсіяному світлі, залишається живим до 7 міс, в сухому посліді — до 12 міс, у глибокій підстилці —12 міс, а в приміщеннях, які не обігріваються — більше дев’яти років. Нагрівання до 60°С знищує збудника через 30—50 хв, але М. bovis витримує таку температуру навіть протягом 65 хв. При 80 °С туберкульозні бактерії гинуть через 5 хв, при кип'ятінні — у перші хвилини. В молоці резистентність мікробів посилюється і для їх знищення продукт необхідно нагрівати до 85°С протягом 30 хв, або до 90°С — 5 хв. Прямі сонячні промені інактивують збудника через 60 хв. Вплив мінеральних кислот мікроб переносить добре. В 5—10 %- ному розчині сірчаної кислоти залишається життєздатним протягом 24 год. У зв’язку з цим для дезінфекції при туберкульозі застосовують такі речовини як фоносмолін, який у 8 %-ній емульсії знищує туберкульозних мікробів у ґрунті на глибині до 5 см через 24—48 год. 0,5%-ний розчин естостерилу знищує цих мікробів уже через 30 хв. Ефективними виявилися також 0,5%-ні розчини парасоду, фоспару й метафору. Тривалий час збудник туберкульозу виживає в молоці і молочних продуктах. Якщо у молоці, він виживає при кімнатній температурі до 14—18 днів, то в сирі — 260, маслі — 300, а в молоці, яке зберігають у холодильнику,— до 280 днів. В замороженому м'ясі мікобактерії туберкульозу залишаються живими до року. 422 Патогенність. Найбільш чутливі до захворювання мавпи, морські свинки, велика рогата худоба, кролі, деякі інші тварини та люди. До резистентних тварин відносять бyйвoлiв, кіз, віслюків, собак і кoнeй. Деякі види тварин можуть бути чутливими до одного і навіть трьох видів збудника. Наприклад, морські свинки, мавпи чутливі до мікобактерій людського і бичачого видів, а кролі — бичачого та пташиного. Зараження при туберкульозі відбувається аерогенним, аліментарним і іншими шляхами. На місці вторгнення мікробів роз- вивається запалення з ушкодженням тканин, серозним набряком і навіть випадінням фібрину. Навколо вогнища запалення інтенсивно розмножуються клітинні елементи, внаслідок чого формуються тубер- кули величиною від макового до просяного зерна і більші, У складі останніх є епітеліоїдні і гігантські клітини, які з'являються у резуль- таті трансформації проліферуючих гістіоцитів. Захоплені макрофагами мікобактерії знищуються лише частково, більшість ізних виживає і під впливом токсинів, що виділяються ними, відбувається проліферація макрофагальних елементів, з’являються лейкоцити та лімфоїдні клітини. В центрі туберкула клітини некротизуються за казеозним типом, у зв'язку з чим вміст туберкула нагадує сирнисту масу. Поступово навколо нього утворюється сполучнотканинна капсула, а сам вузлик петрифікується. Первинний афект, що утворився, або загоюється і мікобактерії у ньому гинуть (за умови високої резистентності організму), або ж прогресує. При цьому збудник лімфогенним шляхом поширюється в організмі, внаслідок чого туберкульозний процес часто уражує, лімфатичні вузли (бронхіальні, заглоткові, підщелепні та ін.). Незважаючи на те, що аліментарно тварини заражаються часто, 423 кишечник уражується рідко. Збудник туберкульозу проникає в лім- фатичні вузли брижі, де й розвивається патологічний процес. В туберкулах, навіть інкапсульованих, мікобактерії можуть збе- рігатись тривалий час. При прогресивному розвитку інфекції організм тварини постійно знаходиться під впливом токсинів збудника, токсичних продуктів, що виникають внаслідок загибелі клітин і некрозутканин.Тварини поступово худнуть, знижують і навіть втрачають продуктивність і в деяких випадках гинуть від інтоксикації та втрати маси тіла. Діагностика. Застосовують бактеріологічний, серологічний та алергічний методи діагностики туберкульозу. Бактеріологічний метод передбачає проведення бактеріоскопії, виділення чистої культури збудника і постановку біопроби. Для прижиттєвої діагностики від тварин відбирають проби молока, бронхіального слизу, фекалій. Після загибелі або забою беруть шматочки печінки, селезінки, легень і лімфатичні вузли. При наявності змін в органах відбирають ділянки з свіжими туберкулами. Матеріал в лабораторію пересилають у термосах з льодом або консервують 30 % - ним стерильним водним розчином гліцерину. При виготовленні мазків для бактеріоскопії на межі здорової і ураженої тканин беруть шматочок матеріалу, який розтираютьміж двома предметними скельцями. У зв'язку з тим, що в них мікобактерій може бути мало, застосовують збагачення, суть якого полягає у центрифугуванні суспензії матеріалу при 3—5 тис. об./хв протягом 10—15 хв. При цьому мікобактерії випадають в осад, з якого й готують мазки. Збагачення матеріалу можна досягти і методом флотації, який збільшує кількість збудника в полі зору не менше ніж на 10 %. Суть 424 методу полягає у тому, що розтертий в ступці матеріал до консистенції сметани змішують порівну в 1 %-ним розчином їдкого натру, гомогенізують на шуттель-апараті, додають невелику кількість ксилолу або авіаційного бензину. Після 30-хвилинного відстоювання на поверхні суспензії у флаконі утворюється флотаційне кільце, в якому за рахунок спливання концентруються мікобактерії. З флотаційного кільця також готують мазки. Із кожного матеріалу готують по два мазки, один зяких фарбують за методом Ціля — Нільсена, другий — флюорохромами для люмінесцентної мікроскопії. Мазки фіксують над полум'ям, потім фарбують протягом 10 хв сумішшю флюорохромів (на 100 мл дистильованої води беруть 0,1 г аураміну 00 і 0,01 г родаміну С). Препарат промивають водою і протягом 15 с знебарвлюють солянокислим спиртом (до 97 мл 70°-ного етилового спирту додають 3 мл соляної кислоти), знову промивають водою. Для погашення фону на препарат наносять на 2 хв розчин кислого фуксину (у 500 мл дистильованої води розчиняють 1 г кислого фуксину i 1 г льодяної оцтової кислоти), додатково обробляють 2 хв розчином метиленової синьки Лефлера, промивають водою і висушують. Препарат досліджують у люмінесцентному мікроскопі. Мікобактерії за рахунок високого вмісту ліпідів інтенсивно поглинають флюорохроми і світяться золотистим кольором. За методом Ціля—Нільсена мікобактерії фарбуються у рубіново-червоний колір, розміщуються частіше невеликими скупченнями і поодинці. |